Summary

Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

Published: January 17, 2019
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per generare cloni delle cellule di cancro che contiene un tag di sequenza MS2 presso un singolo subtelomeriche. Questo approccio, basandosi sul sistema MS2-GFP, permette la visualizzazione delle trascrizioni endogene di telomerica ripetizione-contenente RNA (TERRA) espresso da un singolo telomero in cellule viventi.

Abstract

I telomeri sono trascritti, dando luogo a telomeric repeat-contenente RNA lunghi non codificanti (TERRA), che sono state proposte per svolgere un ruolo importante nella biologia del telomero, tra cui la formazione dell’eterocromatina e nell’omeostasi di lunghezza del telomero. Recenti scoperte hanno rivelato che TERRA molecole interagiscono anche con interne regioni cromosomiche per regolare l’espressione genica in cellule staminali embrionali (ES) del topo. In linea con questa prova, RNA fluorescenza in situ di ibridazione (RNA-pesce) analisi hanno mostrato che solo un sottoinsieme di TERRA trascrizioni localizzare alle estremità del cromosoma. Una migliore comprensione delle dinamiche di molecole TERRA vi aiuterà a definire la loro funzione e meccanismi di azione. Qui, descriviamo un metodo per etichettare e visualizzare trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cellule di cancro usando il sistema di MS2-GFP. A questo scopo, vi presentiamo un protocollo per generare cloni stabili, utilizzando la linea cellulare del cancro AGS stomaco umano, che contiene le sequenze di MS2 integrate a un singolo subtelomeriche. Trascrizione di TERRA dal telomero MS2-etichetta provoca l’espressione di molecole TERRA MS2-Tag che vengono visualizzate da microscopia di fluorescenza di cellule vive al momento di co-espressione di una proteina di legame al RNA MS2-fusa a GFP (MS2-GFP). Questo approccio consente ai ricercatori di studiare la dinamica delle single-telomero TERRA molecole nelle cellule tumorali, e può essere applicato ad altre linee cellulari.

Introduction

La TERRA di RNA lunghi non codificanti è trascritto dalla regione subtelomerica dei cromosomi e la trascrizione procede verso le estremità del cromosoma, che chiude all’interno del tratto di ripetizione telomerica1,2. Per questo motivo, trascrizioni TERRA sono costituiti da sequenze subtelomeric derivata alla loro estremità 5′ e terminare con ripetizioni telomeriche (UUAGGG nei vertebrati)3. Importanti ruoli sono stati proposti per TERRA, tra cui la formazione dell’eterocromatina presso i telomeri4,5, DNA replication6, promuovendo una ricombinazione omologa tra cromosoma termina7,8 , 9, regolazione del telomero struttura10e lunghezza del telomero omeostasi2,11,12,13. Inoltre, trascrizioni TERRA interagiscono con numerosi siti di extratelomeric alla regolazione dell’espressione genica diffusa di cellule staminali embrionali (ES) del mouse14. In linea con queste prove, ibridazione in situ di fluorescenza RNA (RNA-pesce) analisi hanno mostrato che solo un sottoinsieme delle trascrizioni TERRA di localizzare a telomeri1,2,15. Inoltre, la TERRA è stata segnalata a formare aggregati nucleari localizzazione presso i cromosomi X e Y del mouse le celle2,16. Questi risultati indicano che le trascrizioni TERRA subiscono complesse dinamiche all’interno del nucleo. Comprensione delle dinamiche delle molecole TERRA vi aiuterà a definire la loro funzione e meccanismi di azione.

Il sistema di MS2-GFP è stato ampiamente utilizzato per visualizzare le molecole di RNA in cellule viventi da vari organismi17,18. Questo sistema è stato utilizzato in precedenza per tag e visualizzare le molecole TERRA di singolo-telomero in S. cerevisiae12,19. Utilizzando questo sistema, è stato recentemente dimostrato che le trascrizioni TERRA di lievito localizzare all’interno del citoplasma durante la fase di spostamento post-Coelho, suggerendo che la TERRA possa esercitare funzioni extranucleari20. Noi abbiamo recentemente utilizzato il sistema di MS2-GFP per studiare le trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cancro cellule21. A questo scopo, abbiamo impiegato lo strumento di modifica di genoma CRISPR/Cas9 di integrare MS2 sequenze a un singolo telomero (telomero 15q, qui di seguito Tel15q) ed abbiamo ottenuto cloni che esprimono MS2-etichettate endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 cloni). Co-espressione di una proteina legante il RNA MS2 fusi con GFP (MS2-GFP) che riconosce e lega RNA MS2 sequenze consente visualizzazione delle trascrizioni di singolo-telomero TERRA in vita cellule21. Lo scopo del protocollo illustrato qui è quello di descrivere in dettaglio i passaggi necessari per la generazione di cloni di TERRA-MS2.

Per generare cloni di TERRA-MS2, una cassetta di MS2 è integrata all’interno della regione subtelomerica del telomero 15q, a valle del sito di inizio TERRA promotore regione e trascrizione. La cassetta di MS2 contiene un gene di resistenza di neomicina affiancato da siti lox-p, e la sua integrazione a subtelomeriche 15q viene eseguita utilizzando il sistema CRISPR/Cas922. Dopo trasfezione di MS2 cassetta, singolo cloni sono selezionati e subtelomeric integrazione della cassetta è verificato mediante PCR, DNA sequencing e Southern blot. Cloni positivi sono infettati con un adenovirus che esprimono Cre al fine di rimuovere il marcatore di selezione nel cassetto, lasciando solo sequenze di MS2 e un sito singolo lox-p a subtelomeriche 15q. Espressione delle trascrizioni TERRA MS2-contrassegnati da Tel15q è verificata da RT-qPCR. Infine, si esprime la proteina di fusione GFP-MS2 in TERRA-MS2 cloni tramite infezione retrovirale per visualizzare trascrizioni MS2-TERRA mediante microscopia a fluorescenza. Trascrizioni TERRA possono essere facilmente individuate da RNA-pesce e cellule vive imaging utilizzando telomeric repeat specifiche sonde1,2,15,23. Questi approcci forniscono importanti informazioni sulla localizzazione della popolazione totale di molecole TERRA a risoluzione di singola cellula. La generazione di cloni contenenti sequenze di MS2 presso un singolo subtelomeriche permetterà ai ricercatori di studiare le dinamiche delle trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cellule viventi, che contribuiranno a definire la funzione e meccanismi di azione di TERRA.

Protocol

1. Selezione di cloni resistenti neomicina Crescere le cellule AGS in medium F-12_K di Ham (Kaighn) completate con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno) e streptomicina (0,2 µ g / mL di medium) a 37 ° C e 5% CO2. Transfect le cellule in una confluenza di 50-60% con il sgRNA/Cas9 esprimendo vettoriale e la cassetta di MS2 presso un 01:10 rapporto molare21.Nota: In un esperimento parallelo, verificare l’efficienza di t…

Representative Results

Figura 1 rappresenta una panoramica della strategia sperimentale. I passaggi principali del protocollo e un calendario indicativo per la generazione di cloni di TERRA-MS2 in cellule AGS sono illustrati (Figura 1A). Giorno 1, più pozzetti di una piastra ben 6 transfected con la cassetta di MS2 e sgRNA/Cas9 esprimendo vettori (illustrati nella Figura 1B)…

Discussion

In questo articolo presentiamo un metodo per generare cloni di cellule tumorali umane contenenti sequenze di MS2 integrati all’interno di subtelomeriche 15q. Utilizzando questi cloni, le molecole di MS2-etichetta TERRA trascritte da subtelomeriche 15q vengono rilevate da microscopia di fluorescenza di co-espressione di una proteina di fusione GFP-MS2. Questo approccio consente ai ricercatori di studiare la dinamica della TERRA espressa da un singolo dei telomeri in vita cellule21. In questo protoc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati per il personale della struttura imaging avanzata del CIBIO presso l’Università di Trento e l’impianto di microscopia luce BioOptics a Max F. Perutz laboratori (MFPL) a Vienna. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto non finanziamenti dalla Stiftung Mahlke-Obermann e il settimo programma dell’Unione europea quadro di ricerca, sviluppo tecnologico e dimostrazione sotto convenzione di sovvenzione 609431 CE. CE è supportato da un fellowship di Montalcini dal Ministero dell’istruzione Università e ricerca (MIUR).

Materials

AGS cells Gift from Christian Baron (Université de Montréal).
F12K Nut Mix 1X GIBCO 21127022 Culturing medium for AGS cells
L-Glutamine  CORNING MT25005CI Component of cell culturing medium
Penicillin Streptomycin Solution CORNING 30-002-CI Component of cell culturing medium
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 Component of cell culturing medium
DMEM 1X GIBCO 21068028 culturing medium for phoenix cell
CaCl2 Sigma Aldrich C1016 used in phoenix cell transfection
HEPES Sigma Aldrich H3375 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
KCl Sigma Aldrich P9333 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
Dextrose Sigma Aldrich D9434 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
NaCl Sigma Aldrich S7653 used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 used in phoenix cell transfection (HBS solution)
TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X CORNING 59430C used in cell split
DPBS 1X GIBCO 14190250 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
DMSO Sigma Aldrich D8418 Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO)
G-418 Disulphate Formedium G4185 selection drug for 
Gelatin solution Bioreagent Sigma Aldrich G1393 cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate
Tris-base Fisher BioReagents 10376743 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
EDTA Sigma Aldrich E6758 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
SDS Sigma Aldrich 71729 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
Proteinase K Thermo Fisher AM2546 Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction
RNAse A Thermo Fisher 12091021 RNA degradation during DNA extraction
Agarose Sigma Aldrich A5304 DNA gel preparation
Atlas ClearSight Bioatlas BH40501 Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel
ethanol Fisher BioReagents BP28184 DNA precipitation
Sodium Acetate  Sigma Aldrich 71196 Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2
Wizard SV Gel and PCR clean-Up system Promega A9282 Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones
Trizol AMBION 15596018 Organic solvent used for RNA extraction
Dnase I THERMO SCIENTIFIC 89836 degradation of genomic DNA from RNA 
dNTPs mix Invitrogen 10297018 used in RT and PCR reactions
DTT Invitrogen 707265ML used in RT reactions
diethyl pyrocarbonate Sigma Aldrich D5758 used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution)
Ribolock Thermo Fisher EO0381 RNase inhibitor
MOPS Sigma Aldrich M9381 preparation of RNA gel
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS)
Superscript III Reverse transcriptase Invitrogen 18080-093 Retrotranscription reaction
Pfu DNA polymerase (recombinant) Thermo Scientific EP0501 PCR reaction
2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX PCR BIOSYSTEMS PB 20.14 qPCR reaction
Cre-GFP adenovirus https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887 used to promote retrovirus particles production in phoenix cells
PEG8000 Sigma Aldrich 89510 Precipitation of retrovirus partcles
35µ-Dish Glass Bottom Ibidi 81158 used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones

References

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Avogaro, L., Oss Pegorar, C., Bettin, N., Cusanelli, E. Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells. J. Vis. Exp. (143), e58790, doi:10.3791/58790 (2019).

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