Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per generare cloni delle cellule di cancro che contiene un tag di sequenza MS2 presso un singolo subtelomeriche. Questo approccio, basandosi sul sistema MS2-GFP, permette la visualizzazione delle trascrizioni endogene di telomerica ripetizione-contenente RNA (TERRA) espresso da un singolo telomero in cellule viventi.
Abstract
I telomeri sono trascritti, dando luogo a telomeric repeat-contenente RNA lunghi non codificanti (TERRA), che sono state proposte per svolgere un ruolo importante nella biologia del telomero, tra cui la formazione dell’eterocromatina e nell’omeostasi di lunghezza del telomero. Recenti scoperte hanno rivelato che TERRA molecole interagiscono anche con interne regioni cromosomiche per regolare l’espressione genica in cellule staminali embrionali (ES) del topo. In linea con questa prova, RNA fluorescenza in situ di ibridazione (RNA-pesce) analisi hanno mostrato che solo un sottoinsieme di TERRA trascrizioni localizzare alle estremità del cromosoma. Una migliore comprensione delle dinamiche di molecole TERRA vi aiuterà a definire la loro funzione e meccanismi di azione. Qui, descriviamo un metodo per etichettare e visualizzare trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cellule di cancro usando il sistema di MS2-GFP. A questo scopo, vi presentiamo un protocollo per generare cloni stabili, utilizzando la linea cellulare del cancro AGS stomaco umano, che contiene le sequenze di MS2 integrate a un singolo subtelomeriche. Trascrizione di TERRA dal telomero MS2-etichetta provoca l’espressione di molecole TERRA MS2-Tag che vengono visualizzate da microscopia di fluorescenza di cellule vive al momento di co-espressione di una proteina di legame al RNA MS2-fusa a GFP (MS2-GFP). Questo approccio consente ai ricercatori di studiare la dinamica delle single-telomero TERRA molecole nelle cellule tumorali, e può essere applicato ad altre linee cellulari.
Introduction
La TERRA di RNA lunghi non codificanti è trascritto dalla regione subtelomerica dei cromosomi e la trascrizione procede verso le estremità del cromosoma, che chiude all’interno del tratto di ripetizione telomerica1,2. Per questo motivo, trascrizioni TERRA sono costituiti da sequenze subtelomeric derivata alla loro estremità 5′ e terminare con ripetizioni telomeriche (UUAGGG nei vertebrati)3. Importanti ruoli sono stati proposti per TERRA, tra cui la formazione dell’eterocromatina presso i telomeri4,5, DNA replication6, promuovendo una ricombinazione omologa tra cromosoma termina7,8 , 9, regolazione del telomero struttura10e lunghezza del telomero omeostasi2,11,12,13. Inoltre, trascrizioni TERRA interagiscono con numerosi siti di extratelomeric alla regolazione dell’espressione genica diffusa di cellule staminali embrionali (ES) del mouse14. In linea con queste prove, ibridazione in situ di fluorescenza RNA (RNA-pesce) analisi hanno mostrato che solo un sottoinsieme delle trascrizioni TERRA di localizzare a telomeri1,2,15. Inoltre, la TERRA è stata segnalata a formare aggregati nucleari localizzazione presso i cromosomi X e Y del mouse le celle2,16. Questi risultati indicano che le trascrizioni TERRA subiscono complesse dinamiche all’interno del nucleo. Comprensione delle dinamiche delle molecole TERRA vi aiuterà a definire la loro funzione e meccanismi di azione.
Il sistema di MS2-GFP è stato ampiamente utilizzato per visualizzare le molecole di RNA in cellule viventi da vari organismi17,18. Questo sistema è stato utilizzato in precedenza per tag e visualizzare le molecole TERRA di singolo-telomero in S. cerevisiae12,19. Utilizzando questo sistema, è stato recentemente dimostrato che le trascrizioni TERRA di lievito localizzare all’interno del citoplasma durante la fase di spostamento post-Coelho, suggerendo che la TERRA possa esercitare funzioni extranucleari20. Noi abbiamo recentemente utilizzato il sistema di MS2-GFP per studiare le trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cancro cellule21. A questo scopo, abbiamo impiegato lo strumento di modifica di genoma CRISPR/Cas9 di integrare MS2 sequenze a un singolo telomero (telomero 15q, qui di seguito Tel15q) ed abbiamo ottenuto cloni che esprimono MS2-etichettate endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 cloni). Co-espressione di una proteina legante il RNA MS2 fusi con GFP (MS2-GFP) che riconosce e lega RNA MS2 sequenze consente visualizzazione delle trascrizioni di singolo-telomero TERRA in vita cellule21. Lo scopo del protocollo illustrato qui è quello di descrivere in dettaglio i passaggi necessari per la generazione di cloni di TERRA-MS2.
Per generare cloni di TERRA-MS2, una cassetta di MS2 è integrata all’interno della regione subtelomerica del telomero 15q, a valle del sito di inizio TERRA promotore regione e trascrizione. La cassetta di MS2 contiene un gene di resistenza di neomicina affiancato da siti lox-p, e la sua integrazione a subtelomeriche 15q viene eseguita utilizzando il sistema CRISPR/Cas922. Dopo trasfezione di MS2 cassetta, singolo cloni sono selezionati e subtelomeric integrazione della cassetta è verificato mediante PCR, DNA sequencing e Southern blot. Cloni positivi sono infettati con un adenovirus che esprimono Cre al fine di rimuovere il marcatore di selezione nel cassetto, lasciando solo sequenze di MS2 e un sito singolo lox-p a subtelomeriche 15q. Espressione delle trascrizioni TERRA MS2-contrassegnati da Tel15q è verificata da RT-qPCR. Infine, si esprime la proteina di fusione GFP-MS2 in TERRA-MS2 cloni tramite infezione retrovirale per visualizzare trascrizioni MS2-TERRA mediante microscopia a fluorescenza. Trascrizioni TERRA possono essere facilmente individuate da RNA-pesce e cellule vive imaging utilizzando telomeric repeat specifiche sonde1,2,15,23. Questi approcci forniscono importanti informazioni sulla localizzazione della popolazione totale di molecole TERRA a risoluzione di singola cellula. La generazione di cloni contenenti sequenze di MS2 presso un singolo subtelomeriche permetterà ai ricercatori di studiare le dinamiche delle trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cellule viventi, che contribuiranno a definire la funzione e meccanismi di azione di TERRA.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo presentiamo un metodo per generare cloni di cellule tumorali umane contenenti sequenze di MS2 integrati all’interno di subtelomeriche 15q. Utilizzando questi cloni, le molecole di MS2-etichetta TERRA trascritte da subtelomeriche 15q vengono rilevate da microscopia di fluorescenza di co-espressione di una proteina di fusione GFP-MS2. Questo approccio consente ai ricercatori di studiare la dinamica della TERRA espressa da un singolo dei telomeri in vita cellule21. In questo protoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per il personale della struttura imaging avanzata del CIBIO presso l’Università di Trento e l’impianto di microscopia luce BioOptics a Max F. Perutz laboratori (MFPL) a Vienna. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto non finanziamenti dalla Stiftung Mahlke-Obermann e il settimo programma dell’Unione europea quadro di ricerca, sviluppo tecnologico e dimostrazione sotto convenzione di sovvenzione 609431 CE. CE è supportato da un fellowship di Montalcini dal Ministero dell’istruzione Università e ricerca (MIUR).
Materials
| AGS cells | – | – | Gift from Christian Baron (Université de Montréal). |
| F12K Nut Mix 1X | GIBCO | 21127022 | Culturing medium for AGS cells |
| L-Glutamine | CORNING | MT25005CI | Component of cell culturing medium |
| Penicillin Streptomycin Solution | CORNING | 30-002-CI | Component of cell culturing medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | Component of cell culturing medium |
| DMEM 1X | GIBCO | 21068028 | culturing medium for phoenix cell |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | used in phoenix cell transfection |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) and retrovirus precipitation |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | used in phoenix cell transfection (HBS solution) |
| TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X | CORNING | 59430C | used in cell split |
| DPBS 1X | GIBCO | 14190250 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | Component of cell freezing medium (80% FBB and 20% DMSO) |
| G-418 Disulphate | Formedium | G4185 | selection drug for |
| Gelatin solution Bioreagent | Sigma Aldrich | G1393 | cotaing of 96 well DNA plate and freezing plate |
| Tris-base | Fisher BioReagents | 10376743 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| SDS | Sigma Aldrich | 71729 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| Proteinase K | Thermo Fisher | AM2546 | Component of Cell lysis buffer for genomic DNA extraction |
| RNAse A | Thermo Fisher | 12091021 | RNA degradation during DNA extraction |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | DNA gel preparation |
| Atlas ClearSight | Bioatlas | BH40501 | Stain reagent used for detecting DNA and RNA samples in agarose gel |
| ethanol | Fisher BioReagents | BP28184 | DNA precipitation |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 71196 | Used for DNA precipitation at a 3M concentration pH5.2 |
| Wizard SV Gel and PCR clean-Up system | Promega | A9282 | Extraction of PCR fragments from agarose gel during PCR screening of neomycin positive clones |
| Trizol | AMBION | 15596018 | Organic solvent used for RNA extraction |
| Dnase I | THERMO SCIENTIFIC | 89836 | degradation of genomic DNA from RNA |
| dNTPs mix | Invitrogen | 10297018 | used in RT and PCR reactions |
| DTT | Invitrogen | 707265ML | used in RT reactions |
| diethyl pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | used to inactivate RNAses in water (1:1000 dilution) |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| MOPS | Sigma Aldrich | M9381 | preparation of RNA gel |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | preparation of denaturating RNA gel (1% PFA in 1x MOPS) |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen | 18080-093 | Retrotranscription reaction |
| Pfu DNA polymerase (recombinant) | Thermo Scientific | EP0501 | PCR reaction |
| 2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX | PCR BIOSYSTEMS | PB 20.14 | qPCR reaction |
| Cre-GFP adenovirus | https://medicine.uiowa.edu/vectorcore | 1174-HT | used to infect TERRA-MS2 clones in order to remove the neomycn gene |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | used to promote retrovirus particles production in phoenix cells |
| PEG8000 | Sigma Aldrich | 89510 | Precipitation of retrovirus partcles |
| 35µ-Dish Glass Bottom | Ibidi | 81158 | used in live cell imaging analyses of TERRA-MS2 clones |
References
- Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318 (5851), 798-801 (2007).
- Schoeftner, S., Blasco, M. A. Developmentally regulated transcription of mammalian telomeres by DNA-dependent RNA polymerase II. Nature Cell Biology. 10 (2), 228-236 (2008).
- Diman, A., Decottignies, A. Genomic origin and nuclear localization of TERRA telomeric repeat-containing RNA: from Darkness to Dawn. FEBS Journal. , (2017).
- Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).
- Montero, J. J., et al. TERRA recruitment of polycomb to telomeres is essential for histone trymethylation marks at telomeric heterochromatin. Nature Communications. 9 (1), 1548 (2018).
- Beishline, K., et al. CTCF driven TERRA transcription facilitates completion of telomere DNA replication. Nature Communications. 8 (1), 2114 (2017).
- Arora, R., et al. RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells. Nature Communications. 5, 5220 (2014).
- Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).
- Graf, M., et al. Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle. Cell. 170 (1), 72-85 (2017).
- Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops. Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).
- Moravec, M., et al. TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe. EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).
- Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres. Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).
- Moradi-Fard, S., et al. Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE. PLoS Genetics. 12 (8), e1006268 (2016).
- Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86-101 (2017).
- Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH. Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).
- Gallardo, F., Chartrand, P. Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells. Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).
- Querido, E., Chartrand, P. Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).
- Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).
- Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast. Current Genetics. , (2018).
- Avogaro, L., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells. RNA Biology. , 1-10 (2018).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yamada, T., et al. Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres. Scientific Reports. 6, 38910 (2016).
- Deng, Z., et al. Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma. Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).
- Casini, A., et al. A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast. Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).
- Nergadze, S. G., et al. CpG-island promoters drive transcription of human telomeres. RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).
- Porro, A., et al. Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres. Nature Communications. 5, 5379 (2014).
- Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells. PLoS One. 7 (4), e35714 (2012).
- Flynn, R. L., et al. Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors. Science. 347 (6219), 273-277 (2015).
- Scheibe, M., et al. Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators. Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).
- Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Masui, O., et al. Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation. Cell. 145 (3), 447-458 (2011).
