Base d’ARN reprogrammation des fibroblastes humains de primaires sur les cellules souches pluripotentes induites

Travailler dans des conditions sans RNase et utiliser des techniques aseptiques lorsque cela est possible. Effectuer toutes les manipulations liées à la culture de cellule sous une hotte à l’aide de techniques aseptiques de sécurité biologique. Suivre les normes de biosécurité institutionnelle pour le travail avec des cellules humaines. 1. les réactifs et équipements pour la préparation de reprogrammation Initiation Préparer les facteurs de reprogrammation encodage cocktails modifié-ARNm. Suivre le protocole déjà publiés10 pour effectuer la transcription in vitro , bouchage et déphosphorylation des procédures pour chaque mis à jour l’ARNm codant le facteur individuel de reprogrammation. Après l’étape de purification finale, éluer les ARNm modifiés avec de l’eau exempte de nucléase, compléter la solution purifiée de mRNA modifiés avec 1 inhibiteur de RNase U/µL, doser les ARNm modifiés à l’aide d’un spectrophotomètre et stocker à-80 ° C pendant 6 mois. Préparer plusieurs parties aliquotes de chaque ARNm modifiés pour réduire le nombre de cycles de gel-dégel.Remarque : Les protocoles similaires pour mis à jour le mRNA production ont été signalés ailleurs5,8,11. Modèles pour la transcription in vitro peuvent être générés par l’amplification par PCR de modèles correspondants de plasmide utilisant les amorces énumérés dans la Table des matières selon le protocole déjà publiés10. Modèles de plasmide pour chaque facteur de reprogrammation (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) et mWasabi (contrôle pour la transfection) sont disponibles auprès de Addgene, un référentiel de plasmide à but non lucratif. Mélanger ensemble tous les ARNm modifiés dans un rapport molaire de 3:1:1:1:1:1 (M3O : SOX2 : KLF4 : cMYC : NANOG : LIN28A) et comprennent 10 % mWasabi modifiée ARNm comme un contrôle pour l’efficacité de transfection. Ajuster la concentration d’ARNm complet mis à jour le reprogrammation mix à une concentration finale de 100 ng/µL par adjonction d’eau exempte de nucléase, additionné de 1 inhibiteur de RNase U/µL. Préparer sept 33 µL d’extraits de la complète modifiée cocktail de l’ARNm. Stocker les aliquotes de reprogrammation mixtes à-80 ° C.Remarque : pour chaque transfection, 1 000 ng du cocktail mis à jour le mRNA est ajouté par puits (c.-à-d., un total de 3 000 ng pour 3 puits). Chaque µL 33 aliquote est dimensionnée pour transfecter 3 puits d’une plaque de format 6 puits et comprend 3 µL d’excès de volume pour tenir compte des erreurs de pipetage. Préparer sept 33 µL d’extraits est suffisante pour effectuer une reprogrammation complète fibroblaste de 3 puits dans une plaque de format 6 puits. Préparer le cocktail de miRNA imite la reprogrammation. Imitations de miRNA dissoudre lyophilisé (Syn-a-miR – 302 a – 3P, Syn-a-miR – 302 b – 3P, Syn-a-miR – 302c – 3P, Syn-a-miR-302d-3 p, Syn-a-miR-367-3 p) à une concentration finale de 5 pmol/µL (5 µM) dans de l’eau exempte de nucléase additionné de 1 U/µL d’inhibiteur de RNase. Préparer plusieurs parties aliquotes de chaque imitateur de miRNA et stocker à-80 ° C pour un stockage prolongé. Mélanger tous les imitateurs de miRNA dans un rapport molaire de 1:1:1:1:1 à une concentration finale de 5 pmol/µL (5 µM). Préparer sept 14 µL d’extraits de la miRNA imite mix. Stocker les aliquotes mixtes à-80 ° C.Remarque : Pour chaque transfection, 20 pmol du miRNA imite mix est ajoutée par puits (c.-à-d., un total de 60 pmol pour 3 puits). Chaque µL 14 aliquote est dimensionnée pour transfecter 3 puits d’une plaque de format 6 puits et comprend 2 µL de l’excès de volume pour tenir compte des erreurs de pipetage. Préparer sept 14 µL d’extraits est suffisante pour effectuer une reprogrammation complète fibroblaste de 3 puits dans une plaque de format 6 puits. Préparer le tampon de transfection. Réchauffez une bouteille de 500 mL et une bouteille de 100 mL de milieu réduit-sérum frais à température ambiante (RT) pendant environ 2 h. Ne pas utiliser un bain d’eau. Transférer un pH-mètre dans une armoire de sécurité biologique. Laver l’électrode de verre du compteur d’eau exempte de nucléase. Calibrer le pH mètre selon les instructions du fabricant. Laver l’électrode à nouveau avec de l’eau exempte de nucléase. Transférer les deux flacons de sérum réduit moyen dans la biosécurité du cabinet. La bouteille de 500 mL RT permet d’ajuster le pH. Mesurer le pH de base du milieu réduit-sérum en insérant l’électrode de verre du compteur pH dans la mémoire tampon. Attendre jusqu’à 1 min avant la lecture du pH sur le compteur. Ajouter 3 à 4 mL de 1 NaOH M dans 500 mL de milieu de sérum réduit, fermez la bouteille et bien mélanger. Attendre jusqu’à 5 min avant d’ouvrir la bouteille pour la mesure de pH. Insérer l’électrode de pH dans la mémoire tampon et attendez que la lecture du compteur pH se stabilise. Continuez à ajouter de petites quantités de 1 NaOH M jusqu’à ce que le pH du milieu réduit-sérum atteigne 8.15 – 8.17. Calibrer le pH mètre plusieurs fois au cours du processus. Si à tout moment, le pH devient supérieur à 8.18, le réduire en ajoutant un milieu frais réduit et le sérum de la bouteille préchauffée 100 mL (étape 1.3.1).Remarque : Le pH du tampon réduit-sérum axée sur le milieu de transfection est essentiel. La reprogrammation sera réussie si le pH de la mémoire tampon de transfection est environ 8,2 ± 0,05 mais peut échouer si le pH est supérieur à 8,25. Par conséquent, il est conseillé d’arrêter d’ajouter NaOH, une fois que pH du tampon atteigne 8.15 – 8.17. Cela garantira que le pH final de la mémoire tampon de transfection est environ 8,2 – 8.22 après stérilisation. Filtre de stériliser le tampon de transfection utilisant un système de filtration sous vide 0,22 µm. Aliquoter le tampon stérilisé dans des tubes de 5 ou 15 mL avec un minimum d’espace aérien. Stocker les aliquotes de la mémoire tampon de transfection jusqu’à 3 mois à 4 ° C. Mesurer le pH des aliquotes périodiquement. Jeter les aliquotes si le pH est supérieur à 8,25. Limiter l’utilisation aliquote à 2 transfections seulement depuis l’exposition de la mémoire tampon de transfection d’air atmosphérique augmente le pH de la mémoire tampon. Préparer le milieu d’expansion de fibroblastes (MEF) : milieu essentiel minimum additionné de 10 % sérum bovin fœtal (FBS), 1 x acides aminés non-essentiels, Supplément de glutamine x 1, 55 µM 2-mercaptoéthanol, 1 x stylo/strep/fungizone. Stocker la MEF à 4 ° C. Préparer le milieu reprogrammation : DMEM/F12 (aucun HEPES) additionné de 20 % knockout sérum remplacement (KOSR), 0,5 x acides aminés non-essentiels, Supplément de glutamine x 0,5, 55 µM 2-mercaptoéthanol, 50 µg/mL d’acide ascorbique, 1 x stylo/strep/fungizone, bFGF 100 ng/mL et 200 ng/mL B18R. Préparer le milieu lors de l’ouverture de reprogrammation sans bFGF et B18R et conserver à 4 ° C. Ne pas l’utiliser au-delà de 1 mois après préparation. Ajouter bFGF et B18R immédiatement avant chaque utilisation d’une partie aliquote de taille pour utilisation du jour. Préparer le milieu de placage en ajoutant 5 % inactivés par la chaleur (HI) FBS dans le milieu de reprogrammation contenant 20 % KOSR sans bFGF et B18R de l’étape 1.5. Préparer les frais moyen le jour de l’utilisation prévue. Ajouter bFGF et B18R immédiatement avant l’emploi au jour J0 de reprogrammation. Calibrer les incubateurs de culture de tissu avant d’initier la reprogrammation conformément aux instructions du fabricant à l’aide d’un analyseur portable de2 CO numérique. Utiliser un incubateur bas-O2 pour les étapes de reprogrammation pour assurer la génération réussie iPSC. 2. culture de fibroblastes de reprogrammation Préparer les fibroblastes avant le lancement de reprogrammation (journée -2). Enduire une nouvelle plaque de culture de tissu de 10 cm avec 5 mL de 0,1 % de gélatine. Touchez ou agiter la plaque pour faire en sorte que la totalité de la surface est enduite. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. Aspirer la gélatine et ajouter 10 mL d’ensemble FEM. côté. Ne pas laisser la surface de la plaque à sécher avant d’ajouter le FEM. Soigneusement aspirer le milieu usé de fibroblastes. Rincer les cellules une fois avec 5 mL de SPD pour enlever le sérum résiduel. Ajouter 3 mL d’EDTA-trypsine. Balançant doucement la plaque afin d’assurer une couverture complète sur les cellules. Aspirer l’excès de liquide, laissant ~ 500 µL de la trypsine. Ne pas trop aspirer, puisque ceci peut sécher et tuer les fibroblastes. Incuber les fibroblastes avec la trypsine-EDTA pendant 3 min à 37 ° C. Retirez la plaque de l’incubateur et doucement mais fermement, appuyez sur le côté de la plaque pour déloger les cellules. Vérifier les cellules au microscope. Si les cellules sont jumelés et flottants, aller de l’avant. Si les cellules sont toujours attachés, incuber pendant 3 min. Rapidement de rinçage/collecter les cellules individuelles à l’aide de 5 mL de MEF pour neutraliser la trypsine-EDTA. Déplacer la suspension de fibroblastes dans un tube conique de 15 mL. Veiller à ce que les cellules soient bien mélangés. Mélanger délicatement la suspension cellulaire pour casser les grosses touffes de cellules, puis compter sur un hémocytomètre. Transfert de 2,5 x 105 cellules dans le plat de 10 cm enduit de gélatine préparée à l’étape 2.1.1. Incuber les cellules pendant la nuit dans les 37 ° C, 5 % CO2 humidifié régulièrement vitroplants incubateur.Remarque : La densité cellulaire est essentielle pour atteindre l’efficacité élevée de reprogrammation, tel qu’il est important que les fibroblastes sont sains et division rapide. Placage de 2,5 x 105 cellules donne une confluence de 40-60 % 2 jours plus tard pour la plupart des échantillons de fibroblastes. Ajuster la quantité en conséquence pour les cellules malades ou sénescentes atteindre la confluence désirée 40-60 % 48 h plus tard. Remplacer le support avec 10 mL de MEF frais le lendemain (jour -1). Plaque les fibroblastes pour initier la reprogrammation (jour 0). Vérifiez que les fibroblastes d’être reprogrammée à la confluence de 40 à 60 % (Figure 2, jour 0). Si les cellules sont sur – ou sous anastomosé, les fibroblastes de passage tel que décrit à l’étape 2.1 et ajuster la densité de placage en conséquence. Culture pendant encore 2 jours. Transférer 4 mL de SPD dans un tube conique de 15 mL. Ajouter 100 µL de recombinantes humaines (rh) laminin-521. Pipetter en haut et en bas pour bien mélanger. Ajouter 1 ml par puits de rhLaminin-521 dilué dans 3 puits d’une plaque 6 puits. Incuber la plaque enduite à 37 ° C pendant 2 h. Chauffer 6 mL de MEF et 4 mL de placage moyenne à 37 ° C. Supplément au milieu placage bFGF à une concentration finale de 100 ng/mL et B18R à une concentration finale de 200 ng/mL. Soigneusement aspirer le milieu usé de fibroblastes (étape 2.2.1). Rincer les cellules avec 5 mL de SPD et ajouter 3 mL d’EDTA-trypsine. En faisant doucement tourner la plaque pour couvrir les cellules avec la trypsine-EDTA. Aspirer l’excès de liquide, laissant ~ 500 µL de trypsine, comme fait à l’étape 2.1.3. Incuber les fibroblastes avec la trypsine-EDTA pendant 3 min à 37 ° C. Retirez la plaque de l’incubateur et doucement mais fermement, appuyez sur le côté de la plaque pour déloger les cellules. Vérifier les cellules au microscope. Si les cellules sont jumelés et flottants, aller de l’avant. Si les cellules sont toujours attachés, incuber pendant 3 min. Rinçage/collecter les cellules individuelles à l’aide de 5 mL de MEF pour neutraliser la trypsine-EDTA. Déplacer la suspension de fibroblastes dans un tube conique de 15 mL. Veiller à ce que les cellules sont bien mélangés et comptent sur un hémocytomètre. Pipetter 12 000 cellules dans 4 mL de milieu de placage préchauffée à l’étape 2.2.4.Remarque : Ne pas centrifuger les cellules à tout moment. Le nombre de cellules plaqués peut être réglé vers le haut ou bas, tel que requis pour les lignes ou rapide-croissance lente, respectivement. Retirez la plaque enduite de l’incubateur et aspirer dilué rhLaminin-521 de la microplaque. Ne laissez pas la surface des puits à sec. Doucement remettre en suspension les cellules dans le milieu d’ensemencement. Pipetter 1 mL de suspension cellulaire dans chaque enduit puits (c.-à-d., 3 000 cellules / puits). Placez les cellules plaqués dans un incubateur de culture tissulaire tri-gaz avec O de2 à 5 % (basse-O2). Une fois que la plaque est fixée, doucement mais complètement disperser les cellules par une alternance entre un mouvement haut/bas puis gauche/droite. Répétez les mouvements 2 fois plus. Incuber les cellules pendant la nuit. Pas agiter la plaque pour mélanger. Pipetter 4 mL de milieu dans un tube conique de 15 mL de reprogrammation et placez-le dans l’incubateur de bas-O2 avec un bouchon desserré s’équilibrer pendant la nuit. Ne pas ajouter de bFGF et B18R jusqu’au lendemain. 3. ouverture de reprogrammation (jour 1) Remarque : Une fois que la reprogrammation est initiée, entretien quotidien est nécessaire pendant environ 1 mois. N’oubliez pas de planifier en conséquence. Tous les incubations de cellule suivantes doivent être effectuées dans des conditions de faible-O2 37 ° C, 5 % de CO2, incubateur de culture de tissu humidifié tri-gaz 5 % O2 . Remplacer le support de placage au moins 1 h avant la transfection. Sortir le milieu équilibré de la reprogrammation de l’incubateur de bas-O2 . Ajouter bFGF à une concentration finale de 100 ng/mL et B18R à une concentration finale de 200 ng/mL. Bien mélanger. Procéder avec 1 bien à la fois, utilisez une pipette 1 mL pour enlever le milieu usé et le remplacer par 1 mL de milieu reprogrammation additionné de bFGF et B18R. Répétez cette opération pour chaque puits. N’utilisez pas d’aspiration sous vide, qui sèche les cellules excessivement, cause un stress et réduit l’efficacité de reprogrammation. Remettez la plaque avec des cellules sur l’incubateur bas-O2 . Transfecter fibroblastes 5 µl de réactif de transfection de RNAiMax par 1 µg d’ADN messagère mis à jour le, et 1 µL de réactif de transfection par 6 pmol de miRNA imite par transfection.Remarque : Les résultats optimaux sont obtenus lorsque transfections procéder pendant 16 à 20 h. Le réactif de transfection est dilué 10 x ; les 100 ng/µL cocktail mis à jour le mRNA est dilué x 5 ; et les imitateurs de miRNA pmol/µL 5 mix est dilué x 8.33 avec le tampon de transfection avant complexation. Voir le tableau 1 pour un résumé de la configuration de transfection. Tout en préparant la transfection mixes, minimiser l’exposition potentielle des réactifs à RNase en suivant les pratiques de laboratoire standard. Equilibrer une partie aliquote de la mémoire tampon de la transfection (étape 1.3) pendant environ 1 h à température ambiante. Ne pas utiliser un bain-marie à 37 ° C ou un incubateur pour réchauffer le tampon de transfection. Supprimer une seule aliquote de mis à jour le mRNA (33 µL) et miRNA imite (14 µL) de-80 ° C et réchauffer à RT pendant environ 3-5 min, jusqu’à ce que décongelés. Ne pas dégeler les aliquotes à 37 ° C. Tournez en leur bas brièvement dans un microtube. Réchauffer le réactif de transfection de RT pour environ 3-5 min. Ne pas utiliser un bain-marie à 37 ° C ou l’incubateur. Inverser le tube fermé 2 à 3 fois pour mélanger le réactif. Faire tourner vers le bas brièvement dans un microtube. Transférer 279 µL du tampon RT transfection dans un tube de microcentrifuge RNase-libre. Ajouter 31 µL de réactif de transfection pour atteindre un volume final de 310 µL. mélanger soigneusement par pipetage. Ne pas vortexer. Incuber le tube à la droite pendant 1 min.Remarque : Ce volume de réactif dilué transfection est suffisant au complexe l’ARNm modifiés et miRNA imite aliquotes de l’étape 3.2.3. Ajouter 132 µL de la mémoire tampon de transfection RT à la quantité de 33 µL d’ARNm mis à jour le. Pipetez doucement pour mélanger : volume final est 165 µL. Ajouter 102.6 µL du tampon transfection RT à la quantité de 14 µL de miRNA imite. Pipetez doucement pour mélanger : volume final est 116,6 µL. Ajouter 165 µL de réactif dilué transfection étape 3.2.5 à la dilué modifiée ARNm de l’étape 3.2.6. Pipette pour mélanger : volume final est 330 µL. Ajouter 116,6 µL de réactif dilué de transfection de l’étape 3.2.5 au mélange de l’étape 3.2.7 imite miRNA dilué. Bien mélanger (volume final est 233,2 µL). Incuber pendant 15 min à ta pour laisser le tampon de transfection de complexes avec les mis à jour le mRNA et miRNA imite. Retirez la plaque avec les cellules de l’incubateur de bas-O2 . Ajouter 100 µL (1 µg) de la complexé modifiée mix transfection ARNm dans chaque puits, goutte à goutte dans le puits. Disperser les complexes de transfection par doucement mais bien agiter la plaque avec un mouvement vers le haut/bas puis gauche/droite. Pas agiter la plaque pour mélanger. Ajouter 66,7 µL (20 pmol) du miRNA complexé imite la transfection mix dans chaque puits, goutte à goutte dans le puits. Disperser des complexes de transfection par doucement mais bien agiter la plaque avec un mouvement vers le haut/bas puis gauche/droite. Pas agiter la plaque pour mélanger. Placez les cellules transfectées dans l’incubateur de tri-gaz avec O de2 à 5 % (basse-O2). Une fois que la plaque est fixée, disperse les complexes de transfection nouveau doucement mais bien agiter la plaque avec un mouvement vers le haut/bas puis gauche/droite. Pipetter 4 mL de reprogrammation moyen dans un tube conique de 15 mL et le placer dans un incubateur bas-O2 avec bouchon desserré s’équilibrer pendant la nuit. Ne pas ajouter de bFGF et B18R jusqu’au lendemain. Tube 1 – dilution RNAiMax (1er mix) Réactif Concentration de Volume Tampon de transfection 279 ΜL RNAiMax (Ajouter 2e) x 10 31 ΜL Total : 310 µL (Incuber 1 min à température ambiante) Tube 2 – mis à jour le mRNA (2ème mélanger) Réactif Concentration de Volume mis à jour le mRNA mix 100 ng/µL (x 5) 33 ΜL Tampon de transfection ΜL 132 Total : 165 µL (ajouter un volume égal de RNAiMax dilué de 1 Tube) Tube 3 – miRNA imite (3e mélange) Réactif Concentration de Volume miRNA imite mix 5 pmol/µL (8,33 x) 14 ΜL Tampon de transfection 102.6 ΜL Total : 116,6 µL (ajouter un volume égal de RNAiMax dilué de 1 Tube) Tableau 1 : Préparation du mélange de transfection. 4. remplacement de reprogrammation moyen entre Transfections (jours 2, 4, 6, 8, 10 et 12) Remplacez la transfection après milieu 16 – 20 h comme décrit dans 3.1.1–3.1.2. Ajouter bFGF à une concentration finale de 100 ng/mL et B18R à une concentration finale de 200 ng/mL en reprogrammation aliquotes moyens. Surveiller les mWasabi expression quotidiennement pour vérifier la qualité de transfection à l’aide d’un microscope configuré pour visualiser EGFP.Remarque : mWasabi expression devrait être minimalement apparent au jour 2 et augmentation de luminosité avec chaque transfection supplémentaire. 5. autres-quotidien Transfections (jours 3, 5, 7, 9, 11 et 13) Effectuez la transfection tel que décrit à l’étape 3.2. Ne changez pas le milieu aux jours de la transfection. Préparer une portion de 4 mL de milieu de reprogrammation et placez-le dans un incubateur bas-O2 s’équilibrer pendant le changement médiatique le jour suivant. Ne pas ajouter de bFGF et B18R jusqu’au lendemain. 6. les procédures à effectuer après la Transfection Final Effectuer des variations moyennes quotidiennes du 14e grâce à environ 17 jours. Chauffer 7 mL de reprogrammation moyenne à 37 ° C. Ajouter bFGF à une concentration finale de 100 ng/mL.Remarque : B18R n’est plus nécessaire après la transfection finale. Au-delà de 14 jours, il n’est plus nécessaire d’équilibrer le milieu du jour au lendemain dans un incubateur bas-O2 . Retirez le support de tous les puits à l’aide d’une pipette sérologique. Continuer à ne pas utiliser d’aspiration. Ajouter 2 mL de reprogrammation additionné de bFGF / puits. Jours 17 et 18, analyser les puits reprogrammés sous un microscope inversé ou dissection. Si les colonies sont forment à proximité les uns aux autres en raison d’un rendement élevé de reprogrammation et ne peut pas être isolés manuellement, séparer les colonies en effectuant un passage facultatif des puits reprogrammés décrits à l’étape 7 ci-dessous. Si les colonies sont rares et bien séparées, choisir manuellement les clones directement à partir de la reprogrammé bien tel que décrit à l’étape 8 et CISP sous-culture conformément aux protocoles standards. 7. la procédure facultative : Passage de cellules provenant de puits reprogrammé sur EDTA Préparer 0,5 mM EDTA (EDTA) au SPD en diluant la solution EDTA 0,5 M. Filtre stériliser EDTA en utilisant un système de filtration sous vide de 0,22 µm. Préparer le milieu de cellules souches (CFP) de pluripotentes exempte d’engraissement (p. ex., mTeSR1) selon les instructions du fabricant. Préchauffer 32 mL de milieu de la CFP à 37 ° C. Enduire tous les puits de deux plaques 6 puits format avec CSEh qualifié de la matrice extracellulaire (ECM) en suivant les instructions du fabricant. Sceller les plaques avec le film de paraffine et les incuber pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer la solution ECM des plaques pré chauffées et remplacez-le par 2 mL de milieu de CFP / puits. Ne laissez pas la surface des puits à sec. Mettez-les de côté. Aspirez le milieu reprogrammation de 2 puits reprogrammés sur un jour où les colonies sont grandes et bien formé (habituellement jour 18). Rincez une fois avec 1 mL d’EDTA et aspirer. Ajouter 1 mL d’EDTA / puits. Incuber pendant 4 min à 37 ° C. Délicatement enlever la plaque de l’incubateur et placez-le dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.Remarque : À ce stade, les cellules peuvent être très faiblement adhérentes et délogent facilement. Soigneusement aspirer EDTA de deux puits. Ajouter 3 mL de milieu de CFP préchauffé à chacune bien traités avec de l’EDTA. Utilisez un grattoir de cellules pour doucement mais complètement déloger les cellules de deux puits. Utiliser une pipette sérologique pour doucement la suspension cellulaire, déposer et briser les grosses touffes. Ne pas pipeter jusqu’à ce que tous les bouquets de cellule ont disparu. Préserver les grappes de l’iPSC.NOTE : Bordé de grosses touffes n’affectera pas l’excroissance des colonie iPSC. S’il y a des touffes de trop grandes cellules, tout simplement éviter de les transférer dans le plat suivant. À l’aide d’une pipette sérologique, répartir uniformément les cellules de chaque puits traitées à l’EDTA par pipetage 0,5 mL dans chaque puits de la plaque de 6 puits ECM-enduit.Remarque : Ne pas combiner les cellules provenant des puits reprogrammés (c.-à-d., reprogrammé bien 1 doit être répartie uniformément dans la première plaque 6 puits, et reprogrammé 2 puits doit être répartie uniformément dans la deuxième plaque 6 puits). Remettez les cellules plaqués sur l’incubateur bas-O2 . Pour répartir les cellules, agiter chaque plaque et-avant-arrière et gauche-droite. Tourbillonner pas. Remplacer le milieu de la CFP par jour. 8. cueillette iPSC Colonies Préchauffer 15 mL de milieu de la CFP à 37 ° C. Enduire tous les puits d’une seule plaque 6 puits d’ECM CSEh qualifié suivant les instructions du fabricant. Sceller les plaques avec du film de paraffine et les incuber pendant 1 heure à température ambiante. Aspirez le milieu de culture des puits servant à recueillir le CISP. Rincez une fois avec 1 mL d’EDTA et aspirer. Ajouter 1 mL d’EDTA / puits. Incuber pendant 4 min à 37° C. Alors que les cellules sont en incubation, aspirer la solution ECM des plaques pré chauffées et remplacez par 2 mL de milieu de CFP / puits. Mettre de côté les plaques. Retirez délicatement la plaque avec le CISP à prélever de l’incubateur et placez-le dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.Remarque : À ce stade, les cellules peuvent être très faiblement adhérentes et délogent facilement. Soigneusement aspirer EDTA. Très doucement, ajouter 3 mL de préchauffé moyen de CFP, prenant soin de ne pas pour déloger les colonies de l’iPSC. Déplacer la plaque à un champ inversé ou dissection afin de mieux visualiser les colonies. Préparer une pipette 1 mL avec un embout stérile. Enfoncer le piston à fond, puis utilisez la pipette pour gratter doucement une colonie tout en tirant lentement liquide dans la pointe pour recueillir la colonie. Dessiner comme moyen peu que possible tout en choisissant la colonie iPSC. Pipetter verticalement pour transférer la colonie, 3 à 4 fois dans un seul puits de la plaque de revêtement ECM de l’étape 8.2. Répétez jusqu’à ce que 6 colonies ont été cueillies et transférés dans des puits individuels. Prélever des pas plus de 2 colonies de tout puits unique si un passage en option décrit à l’étape 7 a été effectuée. Utiliser un protocole standard les cellules souches humaines de congeler dans tous les puits restants. Décongeler et re-plaque stocks congelés Si plus de colonies doivent être cueillies plus tard. 9. caractérisation du CISP Effectuer des TRA-1-60 de coloration pour l’analyse de la reprogrammation de l’efficacité (18 jours).NOTE : 2 / 3 reprogrammé puits sont repiquées pour le prélèvement de la future colonie. Eh bien le restant peut être utilisé pour la coloration des TRA-1-60. Cette intervention peut être réalisée sur la paillasse de laboratoire. Laver le reprogrammé bien avec 1 mL de PBS. Fixer les cellules avec du méthanol glacée à-20 ° C pendant 5 min. Aspirer le méthanol. Sec le puits pendant environ 2 min. Veillez ne pas trop sec. Les cellules ont séché assez quand ils deviennent une couleur translucide/mat. Lavez les bien 3 fois avec 1 mL de PBS pendant 5 min avec agitant doucement. Au cours de la lave, préparer 3 mL de peroxyde d’hydrogène 3 % dans du PBS. Aspirer le PBS. Ajouter 2 mL de solution diluée de peroxyde. Incuber pendant 15 min à ta avec agitant doucement. Préparer 4 mL de la solution de saturation : 10 % l’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS. Aspirer la solution peroxyde. Lavez les bien 2 fois avec 1 mL de PBS pendant 5 min. Aspirer les PBS et ajouter 2 mL de solution de blocage dans le puits. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Lavez les bien 3 fois avec 1 mL de PBS pendant 5 min avec agitant doucement. Diluer l’anticorps primaire anti-TRA-1-60 à 1/100 dans la solution de blocage additionné de 0.05 % d’azide de sodium. Préparer 1 mL de dilution d’anticorps pour 1 bien d’un plat de format 6 puits. Ajouter la dilution d’anticorps dans le puits et enrouler la plaque avec du parafilm pour éviter l’évaporation. Incuber une nuit à 4 ° C sous agitation douce.Remarque : Si nécessaire, l’incubation avec l’anticorps primaire peut être faite pendant 1 h à RT avec agitant doucement. La dilution de l’anticorps primaire peut être réutilisée jusqu’à 5 fois. Après incubation avec l’anticorps primaire, lavez les bien 3 fois avec 1 mL de PBS pendant 5 min avec agitant doucement. Diluer l’anticorps conjugué HRP anti-souris secondaire au 1 : 200 dans la solution de blocage. Incuber le puits avec la dilution de l’anticorps secondaire pendant 2 h à RT avec agitant doucement. Aspirer la dilution de l’anticorps secondaire et lavez les bien 3 fois avec 1 mL de PBS pendant 5 min avec agitant doucement. Lors du troisième lavage, préparer la solution de substrat suivant les instructions du fabricant. Après le lavage final, aspirer PBS. Ajouter 1 mL de la solution de substrat et incuber avant que la couleur souhaitée (environ 10 min). Aspirer la solution de substrat. Rincez le puits avec de l’eau pendant 5 min en secouant doucement. Compter les colonies, si vous le souhaitez. Reprogrammation d’efficacité = (nombre de colonies) / (nombre de fibroblastes plaqués) x 100 %. Pour le stockage à long terme, aspirer l’eau de la plaque teintée et sécher toute la nuit à RT. Seal la plaque sèche avec du parafilm et conserver à 4 ° C jusqu’à 2 ans évaluer l’efficacité de reprogrammation plus tard.