基于 rna 的人原代成纤维细胞重组成诱导多能干细胞

在无 rnase 条件下工作, 并在可能的情况下使用无菌技术。使用无菌技术在生物安全柜中执行所有与细胞培养相关的操作。遵循机构生物安全标准与人体细胞合作。 1. 准备重新编程启动的试剂和设备 准备修改后的 mrna 鸡尾酒编码重新编程因素。 遵循先前公布的协议10 , 对每个修改后的 mrna 编码单个重编程因子执行体外转录、封盖和脱磷酸化过程。最后纯化后, 用无核酸酶水洗脱改性的 mrna, 用 1u/μl rnase 抑制剂补充纯化后的 mrna 溶液, 用分光光度计对改性 mrna 进行定量, 并在-80°c 下储存长达6个月。为每个改性的 mrna 准备多个等价物, 以最大限度地减少冻融循环的数量。注: 其他地方也报告了类似的改性 mrna 生产协议。根据先前公布的协议 10, 可以使用材料表中列出的引物从相应的质粒模板中进行 pcr 扩增, 从而生成体外转录模板.每个重编程因子 (m3o9、sox2、transfection、cmyc、nanog、lin28a) 的质粒模板可从非营利质粒存储库 adgene 获得. 以 3:1x-1: 1 (m3o2:sox2:klf4:cmo:innog:lin28a) 的摩尔比将所有修改后的 mrna 混合在一起, 并包括10% 的 mwasabi 改性 mrna 作为转染效率的控制。通过加入无核酸酶水, 辅以 1uμl rnase 抑制剂, 将完整改性的 mrna 重编程混合物的浓度调整为最终浓度为 100 ngμl。准备 7个33μl 的完整改性 mrna 鸡尾酒。将混合重编程的等价物存放在-80°c。注: 每次转染时, 每口井添加 1, 000 纳克改性 mrna 鸡尾酒 (即3 口井共 3, 000 纳克)。每个 33μl aliquot 的尺寸是为了转染6井格式板的3口井, 并包括3微米的多余体积, 以考虑移液误差。准备 7个33μl 等位器足以完成6井格式板中3口井的全成纤维细胞重新编程。 准备重新编程 mirna 模拟的鸡尾酒。 溶解冻干 mirna 仿制品 (syn-has-mir-3a-3p, syn-has-mir-302-3p, syn-has-32c-3p, syn-has-空运-302-3p, Syn-has-miR-302a-3p) 到 5 pmolμμl (5μm) 最终浓度在无核水中补充了 rnase 抑制剂的1une-μl。准备每个 mirna 的多个等价物模拟并存储在-80°c, 以便进行长期储存。 将所有 mirna 模拟物混合在 1:1: 1 摩尔比中, 最终浓度为 5 pmolμμμl (5μm)。准备 7个14μl 等位基因的 mirna 模拟混合。将混合等价物存放在-80°c。注: 每次转染, 每口井添加 20 pmol 的 mirna 模拟混合物 (即3 口井共 60 pmol)。每个 14μl aliquot 的尺寸是为了转染6井格式板的3口井, 并包括2μl 的多余体积, 以考虑移液误差。准备 7个14μl 等位数足以完成6井格式板中3口井的全成纤维细胞重新编程。 准备转染缓冲器。 预热一个500毫升瓶和一个100毫升的新鲜降-血清中的培养基到室温 (rt) 约2小时。不要使用水浴。 将 ph 计传输到生物安全柜。用无核酸水清洗仪表的玻璃电极。根据制造商的说明校准 ph 计。用无核酸水再次清洗电极。 将两瓶降低血清培养基转移到生物安全柜。使用500毫升 rt 瓶调整 ph 值。 通过将 ph 计的玻璃电极插入缓冲液中, 测量还原血清介质的碱 ph 值。在读取仪表上的 ph 值之前, 请等待1分钟。 在500毫升降糖血清中加入3-4 毫升的 naoh, 关闭瓶子, 搅拌均匀。在打开瓶子进行 ph 测量之前, 请等待5分钟。将 ph 计的电极插入缓冲液中, 然后等待 ph 计上的读数稳定。 继续加入小容量的 1 m naoh, 直到还原血清培养基的 ph 值达到8.15-8.17。在此过程中多次校准 ph 计。如果在任何时候 ph 值高于 8.18, 则通过从预热的 100 ml 瓶 (步骤 1.3.1) 中添加新鲜的降糖血清培养基来降低 ph 值。注: 减少血清中导液转染缓冲液的 ph 值至关重要。如果转染缓冲液的 ph 值约为 8.2±0.05, 则重新编程将成功, 但如果 ph 值高于 8.25, 则可能会失败。因此, 建议在缓冲区的 ph 值达到8.15-8.17 时停止添加 naoh。这将确保经缓冲液的最终 ph 值在灭菌后达到约8.2-8.22。 过滤器使用0.22μm 真空过滤系统对转染缓冲液进行灭菌。将灭菌缓冲液加入5或15毫升管, 空气空间最小。 在4°c 下, 将转染缓冲液的等价物存放3个月。定期测量等价物的 ph 值。如果 ph 值高于 8.25, 请丢弃等价物。仅将脂肪的使用限制在 2次, 因为将转染缓冲液暴露在大气中会增加缓冲液的 ph 值。 制备成纤维细胞膨胀介质 (fem): 以10% 的胎牛血清 (fbs)、1x 非必需氨基酸、1x 谷氨酰胺补充剂、55μm 2-甲氨基乙醇、1x pen/streppcrep/fungizone 为补充的最低必要培养基。将有限元存储在4°c。 准备重新编程介质: dmm/f12 (无 hepes) 补充20% 的淘汰赛血清置换术 (kosr), 0.5倍非必需氨基酸, 0.5 x 谷氨酰胺补充剂, 55μm 2-硫醇, 50μgml 抗坏血酸, 1x pen/strep/fungizone, 100 ng/ml bfgf和 200 ngml b18r。在没有 bfgf 和 bFGF 的情况下, 在重新编程开始时准备介质, 并将其存储在4°c。不要在准备后1个月以上使用。每次使用前立即添加 bfgf 和 bFGF, 以达到当天使用的大小。 在包含 20% kosr 的再编程介质中加入5% 的热失活 (hi) fbs, 从步骤1.5 开始, 在不含 bfgf 和 bFGF 的情况下, 加入5% 的热失活 (hi) fbs, 准备电镀介质。在预定使用的当天准备新鲜的培养基。在重新编程的第0天使用之前立即添加 bfgf 和 bFGF。 根据制造商的说明, 使用手持数字 co2 分析仪, 在开始重新编程之前, 对组织培养孵化器进行校准。使用低 o2孵化器重新编程步骤, 以确保成功生成 ipsc。 2. 培养用于重新编程的成纤维细胞 在重新编程开始之前准备成纤维细胞 (第2天)。 涂上新的10厘米组织培养板, 5 毫升的0.1% 明胶。轻触或旋流板材, 以确保整个表面都被涂覆。在37°c 下孵化15分钟。吸入明胶, 加入10毫升的有限元法. 放在一边。在加入有限元法之前, 不要让板材的涂层表面干燥。 从成纤维细胞中仔细吸气所用的培养基。用5毫升的 dpbs 冲洗细胞一次, 去除残留血清。加入3毫升的色氨酸 edta。轻轻摇晃板, 以确保完全覆盖在细胞上。 吸入多余的液体, 留下约500μl 的胰蛋白酶。不要过度吸气, 因为这样会干燥并杀死成纤维细胞。在37°c 条件下, 用胰蛋白酶-edta 培养成纤维细胞3分钟。 从孵化器中取出盘子, 并用力但轻轻地点击盘子的一侧, 将细胞移开。检查显微镜下的细胞。如果单元格已分离并浮动, 请继续操作。如果细胞仍然附着, 再孵育3分钟。 快速冲洗收集分离细胞使用5毫升的有限元法中和色氨酸 edta。将成纤维细胞悬浮液移入15毫升锥形管。确保单元格混合良好。 轻轻混合细胞悬浮液, 打破大的细胞团块, 然后将其计算在血细胞计上。将 2.5 x 10 5 细胞转移到步骤2.1.1 准备的涂胶10厘米的糊状物盘中。在 37°c, 5% co2 加湿常规组织培养孵化器中孵育细胞.注: 细胞密度是实现高重新编程效率的关键, 因为它是重要的是成纤维细胞是健康的, 并迅速划分。在2天后, 大多数成纤维细胞样本的镀存在 2.5 x 10 5个细胞会产生40-60% 的融合。相应地调整患病或衰老细胞的数量, 以达到所需的40-60% 融合48小时后。 第二天 (第1天) 将介质替换为10毫升新鲜的 fem。 将成纤维细胞进行切片, 以启动重新编程 (第0天)。 验证要重新编程的成纤维细胞是否融合 40–60% (图 2, 第0天)。如果细胞是在融合或下融合, 通过成纤维细胞如步骤2.1 中所述, 并相应地调整电镀密度。文化再过2天。 将4毫升的 dpbs 转移到一个15毫升的锥形管中。加入100μl 的重组人 (rh) 层压-521。上下移液器进行彻底混合。 每井加入1毫升稀释的拉明-521, 放入6井板的3口井中。在37°c 下将涂层板培养2小时。 热6毫升的有限元和4毫升的电镀介质至37°c。用 bfgf 将电镀介质补充到最终浓度为 100 ngml 和 bFGF, 最终浓度为 200 ng/ml。 从成纤维细胞中仔细吸气所用培养基 (步骤 2.2.1)。用5毫升的 dpbs 冲洗细胞, 加入3毫升的胰蛋白酶-edta。轻轻摇晃板, 用胰蛋白酶 edta 覆盖细胞。 吸入多余的液体, 留下 ~ 500μl 的胰蛋白酶, 如步调式2.1.3。在37°c 条件下, 用胰蛋白酶-edta 培养成纤维细胞3分钟。从孵化器中取出盘子, 并用力但轻轻地点击盘子的一侧, 将细胞取出。检查显微镜下的细胞。如果单元格已分离并浮动, 请继续操作。如果细胞仍然附着, 再孵育3分钟。 Rinse/collect 使用5毫升的有限元法收集分离细胞, 中和胰蛋白酶-edta。将成纤维细胞悬浮液移入15毫升锥形管。确保细胞混合良好, 并将其计数在血细胞计上。从步进2.2.4 将 12, 000个细胞放入4毫升预热电镀介质中。注: 不要在任何时候对电池进行离心。镀金单元的数量可以根据慢线或快速增长线的需要向上或向下调整。 从孵化器中取出涂层板, 从涂布井中吸气稀释的罗明-521。不要让水井表面干燥。在电镀介质中轻轻重新悬浮细胞。移液器1毫升的细胞悬浮液进入每个涂层井 (即每口井 3, 000个细胞)。 将镀金细胞放入 o2 设置为 5% (低 o2) 的三气组织培养孵化器中。一旦板被设置下来, 轻轻但彻底分散细胞之间交替向上/向下, 然后左/右的运动。再重复重复重复2次。将细胞连夜孵化。不要旋转盘子混合。 移液器4毫升重新编程介质到15毫升锥形管, 并将其放置在低 o2孵化器与一个松动的盖子, 以平衡一夜。直到第二天才添加 bfgf 和 bFGF。 3. 重新编程的启动 (第1天) 注: 一旦重新编程启动, 需要进行大约1个月的日常维护。一定要有相应的计划。所有随后的细胞培养必须在低 o2 条件下进行 37°c, 5% co 2, 5% o2 加湿的三气组织培养孵化器. 在转染前至少1小时更换电镀介质。 从低 o2 孵化器中取出均衡的再编程介质.将 bfgf 添加到最终浓度为 100 ngml 和 bFGF 的最终浓度为 200 ngml。混合好。 一次进行1口井, 使用1毫升移液器去除使用的介质, 并将其替换为1毫升的重新编程介质, 再加上 bfgf 和 bFGF。对每口井重复此操作。不要使用真空抽吸, 真空抽吸会使细胞过度干燥, 造成压力, 并降低重新编程效率。将带有细胞的板移回低 o2孵化器。 每1微克改性 mrna 用5μl 的 rnax 转染试剂转染成纤维细胞, 每转染一次, 每 6 pmol 模拟剂每转染一次, 转染转化试剂为1微米升。注: 当转染持续16–20小时时, 可获得最佳结果。转染试剂稀释 10倍;100 ngμμl 改性 mrna 鸡尾酒稀释 5倍;5 pmolμ-α模拟物混合稀释 8.33 x 与转染缓冲剂在络合前。有关转染设置的摘要, 请参见表 1 。 在准备转染混合物时, 遵循标准的实验室实践, 最大限度地减少试剂对 rnase 的潜在接触。 在 rt 中平衡转染缓冲液 (步骤 1.3) 的一个例外约1小时。不要使用37°c 的水浴或孵化器来加热转染缓冲液。 从-80°c 中取出改性 mrna (33μl) 和 mirna 模拟物 (14μl), 将其加热约 3-5分钟, 直到解冻。不要在37°c 下解冻。在微泡中短暂地旋转它们。 将转染试剂加热约3-5分钟。请勿使用37°c 的水浴或孵化器。将封闭管反转2-3 次, 以混合试剂。在微泡中短暂旋转。 将 rt 转染缓冲液的279μl 转移到无 rnase 的微离心管中。加入31μl 的转染试剂, 通过移液彻底混合, 最终体积为310μl。不要漩涡。在 rt 处为管材提供1分钟的经费。注: 稀释转染试剂的体积足以使修改后的 mrna 和 mirna 模拟从3.2.3 步骤开始的等价物。 在30μl 改性 mrna 中加入132μl 的 rt 转染缓冲液。轻轻的移液器混合: 最终体积为165μl。 在 mirna 模拟剂的14μl 像中加入102.6 μl 的 rt 转染缓冲液。轻轻的移液器混合: 最终体积为16.6μl。 将稀释后的转染试剂从步骤3.2.5 添加 165μl, 从步骤3.2.6 添加到稀释的改性 mrna 中。混合的移液器: 最终体积为330μl。 将稀释后的转染试剂从步骤3.2.5 添加到从步骤3.2.7 混合的稀释 mirna 模拟剂中。搅拌均匀 (最终体积为 233.2μl)。在 rt 中培养 15分钟, 使转染缓冲液与改良的 mrna 和 mirna 模拟复合。 用低 o2 孵化器中的细胞取出盘子。在每口井中加入 100μl (1μg) 的复合改性 mrna 转染混合物, 滴至井内。通过轻轻但彻底地搅拌板, 然后左/右的运动, 分散转染配合物。不要旋转盘子混合。 添加 66.7μl (20 pmol) 的络合 mirna 模仿转染混合到每口井, 滴至井对面。通过轻轻但彻底地搅拌板, 然后左/右的运动, 分散转染配合物。不要旋转盘子混合。 将转染的细胞放入 o2 设置为 5% (低 o2) 的三气孵化器中.一旦板被设置下来, 再次分散转染配合物轻轻但彻底搅拌板向上/向下, 然后左/右的议案。 将介质重新编程到15毫升锥形管中, 并将其放置在低 o2孵化器中, 并将其与松盖放在一起, 以平衡一夜。直到第二天才添加 bfgf 和 bFGF。 管 1-rnaimax 稀释 (第一次混合) 试剂 浓度 体积 转染缓冲器 279μl rnax (添加第二个) 10倍 31μl 总计: 310μl (室温下孵育 1分钟) 管 2-改性 mrna 混合 (第2次混合) 试剂 浓度 体积 改性 mrna 混合 100 ngμl (5倍) 33μl 转染缓冲器 132μl 总计: 165μl (从管1中添加相等的稀释 rnax) 管 3-mirna 模拟混合 (第3次混合) 试剂 浓度 体积 mirna 模拟混合 5 pmopμl (8.33x) 14μl 转染缓冲器 102.6 μl 总计: 16.6μl (从管1中添加相等的稀释 rnax) 表 1: 转染混合物的制备。 4. 替换转换之间的替换介质 (第2、4、6、8、10和12天) 如 3.1.1 3.1.2 中所述, 在转染后16–20小时更换介质。将 bfgf 加入 100 ngml 和 bFGF 的最终浓度, 最终浓度为 200 ngml, 以重新编程中的 aliquots。 每天监测 mwasabi 表达, 以确认转染质量使用显微镜配置可视化 transfection。注: mwasabi 表达应在第2天最低明显, 并增加亮度与每一个额外的转染。 5. 日常转染 (第3、5、7、9、11和13天) 按照步骤3.2 中的说明执行转染。不要在转染的日子改变介质。 准备一个4毫升的重新编程介质, 并将其放置在低 o2孵化器中, 以平衡第二天的介质变化。直到第二天才添加 bfgf 和 bFGF。 6. 最终转染后要执行的程序 执行从第14天到大约第17天的每日介质更改。将介质重新编程到37°c 的温度为7毫升。加入 bfgf 到最终浓度为 100 ngml。注: b18r 在最终转染后不再需要。在第14天之后, 不再需要在低 o2 孵化器中夜间平衡介质. 使用血清学移液器从所有井中取出介质。继续避免使用渴望。加入2毫升的重新编程介质, 再加上每口 bfgf。 在第17天和第18天, 在倒置或解剖显微镜下分析重新编程的井。如果由于重新编程的高效率而在彼此接近的情况下形成菌落, 并且不能手动隔离, 则通过执行下面步骤7中所述的重新编程井的可选传递来分离菌落。如果菌落稀疏且分离良好, 请根据标准协议, 从重新编程的区域中直接选择克隆体, 并在步骤8和亚培养 ipsc 中进行描述。 7. 可选程序: 使用 edta 从重新编程的井中传代细胞 通过稀释 0.5 m edta 库存解决方案, 在 dpbs (edta) 中准备 0.5 mm edta。使用0.22μm 真空过滤系统对 edta 进行灭菌。 根据制造商的说明制备无系体多能干细胞 (psc) 培养基 (例如, mtesr1)。预热32毫升的 psc 介质至37°c。 按照制造商的说明, 用 hesc 合格的细胞外基质 (ecm) 为两个6孔格式板的所有油井涂上涂层。用石蜡膜密封板, 并在 rt 孵育1小时。 从预热板中吸收 ecm 溶液, 并将其替换为每口2毫升的 psc 介质。不要让水井表面干燥。把它们放在一边。 在菌落大而清晰的一天 (通常是第18天), 从2口重新编程的井中吸收重新编程介质。用1毫升的 edta 冲洗一次, 吸气。 每口添加1毫升 edta。在37°c 下孵化4分钟。 轻轻地从孵化器上取下盘子, 放在生物安全柜里。注: 此时, 细胞可能非常松散粘附, 并且很容易被移出。 从两口井仔细吸气 edta。在每种经过 edta 处理的良好处理中加入3毫升预热 psc 培养基。使用刮刀轻轻但彻底地将细胞从两口井中取出。 使用血清学移液器轻轻地移液细胞悬浮液, 并打破大团块。在所有单元格团块都消失之前, 不要移液器。保留 ipsc 群集。注: 电镀大型团块不会影响 ipsc 菌落的生长。如果有过大的细胞团块, 只需避免将它们转移到下一道菜中。 使用血清学移液器, 通过将 0.5 ml 的移液液移入 ecm 涂层的6孔板的每一口井, 均匀地将每个 edta 处理良好的细胞均匀地分配。注: 不要将重新编程的井中的细胞组合在一起 (即,重新编程的井1应均匀地分布在第一6井板中, 而重新编程的井2应均匀地分布在第二6井板中)。 将镀金细胞移回低 o2 孵化器 。要均匀地分配细胞, 请来回晃动每个板块。不要旋转。每天更换 psc 介质。 8. 挑选 ipsc 殖民地 预热15毫升的 psc 介质至37°c。按照制造商的说明, 用 hesc 合格的 ecm 为单个6井板的所有油井涂上涂层。用石蜡膜密封盘子, 在 rt 孵育1小时。 从用于收集 ipsc 的水井中吸收培养基。用1毫升的 edta 冲洗一次, 吸气。每口添加1毫升 edta。37°C, 孵化4分钟。当细胞孵育时, 从预热板中吸气 ecm 溶液, 每口井用2毫升的 psc 培养基代替。把盘子放在一边。 轻轻取出从孵化器中取出的带有 ipsc 的盘子, 放在生物安全柜中。注: 此时, 细胞可能非常松散粘附, 并且很容易被移出。 仔细吸气 edta。非常温和地添加3毫升预热 psc 介质, 注意不要驱逐 ipsc 菌落。 将板材移动到倒置或解剖范围, 以更好地可视化殖民地。准备一个1毫升的移液器与无菌的尖端。充分按压柱塞, 然后使用移液器尖端轻轻刮伤菌落, 同时慢慢地将液体吸引到柱中收集菌落。在采摘 ipsc 菌落时, 画尽可能少的介质。 要转移菌落, 从步骤8.2 开始, 在 ecm 涂层板的单井中上下液器3-4 次。重复, 直到6个菌落被采摘并转移到各个井中。如果执行了步骤7中描述的可选传递, 则从任何一个井中选择不超过2个菌落。 使用标准的人体干细胞协议冻结所有剩余的油井。解冻和重新板块冷冻股票, 如果必须选择更多的殖民地后。 9. ipsc 的特性 执行 tra-1-60 染色, 以分析重新编程效率 (第18天)。注: 3 口重新编程的井中有2口被通过, 用于未来的群体采摘。剩余的井可用于 tra-1-60 染色。此过程可在实验室台面上执行。 用1毫升的 pbs 清洗重新编程的好。用冰凉甲醇将细胞固定在-20°c 下5分钟。 吸入甲醇。把井擦干大约 2分钟. 小心不要过度干燥。当细胞变成半透明的颜色时, 它们已经足够干燥了。 用1毫升的 pbs 清洗3口, 用轻微的晃动5分钟。在清洗过程中, 在 pbs 中制备3% 过氧化氢的3毫升。 吸收 pbs。加入2毫升稀释的过氧化物溶液。在 rt 用温柔的晃动孵化15分钟。制备4毫升的阻滞溶液: 10% 的牛血清白蛋白 (bsa) 在 pbs 中。 吸出过氧化物溶液。用1毫升的 pbs 清洗2口井5分钟。 吸气 pbs, 并在井中加入2毫升的阻塞溶液。在 rt 孵化1小时。 用1毫升的 pbs 清洗3口, 用轻微的晃动5分钟。 稀释原代抗 tra-1-60 抗体在 1: 100 在阻断溶液中补充0.05% 的氮化钠。为6孔格式的盘准备1毫升抗体稀释。将抗体稀释添加到井中, 用副回液包裹板, 以避免蒸发。在4°c 下过夜, 轻轻晃动。注: 如有必要, 在 rt 处, 用原代抗体进行孵育 1小时, 轻轻晃动。主要抗体稀释可重复使用多达5次。 用原代抗体孵育后, 用1毫升 pbs 清洗井 3次, 用轻微晃动5分钟。 在阻断溶液中以1:200 稀释继发抗小鼠 hrp 共轭抗体。用二次抗体稀释2小时在 rt 用温和的晃动进行井的培养。 用1毫升 pbs 吸干二级抗体稀释, 用1毫升的 pbs 清洗 3次, 轻轻晃动5分钟。 在第三次清洗过程中, 按照制造商的指示制备基板溶液。最后洗完之后, 吸气 pbs。加入1毫升的基板溶液, 孵育, 直到所需的颜色发展 (约 10分钟)。 吸气基板溶液。在轻轻晃动的同时, 用水冲洗5分钟。 如果需要的话, 数一数殖民地。重新编程效率 = (菌落数)/(镀金成纤维细胞数) x 100%。 长期储存时, 从染色板中吸气, 并在 rt 风干一夜, 用副体密封干燥的盘子, 并在4°c 下存放长达 2年, 以评估以后的重新编程效率。