מבוסס-RNA תכנות מחדש של האנושי Fibroblasts הראשי לתוך תאי גזע Pluripotent המושרה

לעבוד תחת התנאים ללא RNase ולהשתמש טכניקות aseptic במידת האפשר. לבצע מניפולציות תרבות הקשורים לכל תא ב- cabinet באמצעות טכניקות aseptic ביטחון ביולוגי. בצע סטנדרטים מוסדיים אבטחה לעבודה עם תאים אנושיים. 1. ראגנטים וציוד עבור הכנה של התכנות חניכה להכין mRNA שונה קוקטייל קידוד התיכנות הגורמים. בצע את פרוטוקול שפורסמו בעבר10 כדי לבצע במבחנה שעתוק, מיצוי, וכן dephosphorylation ההליכים עבור כל mRNA שונה קידוד גורם התיכנות בודדים. לאחר השלב הסופי טיהור, elute של mRNA שונה במים נטולי נוקלאז, שמשלימה את הפתרון mRNA שונה מטוהרים עם מעכב RNase U/µL 1, quantitate את mRNAs ששונתה באמצעות ספקטרופוטומטרים ו לאחסן ב- 80 ° C עד 6 חודשים. להכין aliquots מרובים של כל mRNA שונה כדי לצמצם את מספר מחזורים ההקפאה-הפשרה.הערה: פרוטוקולים דומה עבור mRNA שונה הייצור היה דיווח במקום אחר5,8,11. תבניות עבור במבחנה תמלול יכול להיווצר על ידי הגברה PCR מתבניות פלסמיד המתאימים באמצעות תחל המופיעים בטבלה של חומרים על פי פרוטוקול שפורסמו בעבר10. פלסמיד תבניות עבור כל גורם התיכנות (מ’3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A), mWasabi (פקד על תרביות תאים) הינם זמינים מן Addgene, מאגר פלסמיד ללא כוונת רווח. מערבבים יחד את כל mRNAs שונה ביחס טוחנת של 3:1:1:1:1:1 (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) כוללים 10% mWasabi שונה mRNA כמו פקד עבור יעילות תרביות תאים. התאם את הריכוז של mRNA שונה להשלים התכנות מערבבים היטב עד ריכוז סופי של 100 ng/µL על ידי הוספת מים נטולי נוקלאז בתוספת מעכב RNase U/µL 1. להכין 7 33 aliquots µL של שלמה ששינה mRNA קוקטייל. לאחסן את aliquots התיכנות מעורב ב-80 מעלות צלזיוס.הערה: עבור כל תרביות תאים, 1,000 ng של. קוקטייל mRNA שונה יתווסף לכל טוב (קרי, סך של 3,000 ng עבור 3 בארות). כל µL 33 aliquot מותאם transfect 3 בארות של צלחת תבנית 6-ובכן, כולל 3 µL של אמצעי אחסון עודף עבור שגיאות pipetting. הכנת שבע 33 µL aliquots מספיקה להשלים מלא פיברובלסט התכנות של 3 בארות בצלחת תבנית 6-. טוב. להכין את הקוקטייל של התכנות מחקה miRNA. התמוססות lyophilized miRNA מחקה (Syn-יש-מיר-302a – 3p, Syn-יש-מיר-302b – 3p, Syn-יש-מיר – 302c – 3p, p Syn-יש-מיר-302d-3, Syn-יש-מיר-367-3 p) כדי ריכוז סופי 5 pmol/µL (5 מיקרומטר) במים נטולי נוקלאז בתוספת 1 U µL של RNase מעכב. להכין aliquots מרובים של כל לחקות miRNA ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. מערבבים כל מחקה miRNA ביחס 1:1:1:1:1 טוחנת את ריכוז הסופי של 5 pmol/µL (5 מיקרומטר). להכין 7 14 aliquots µL של miRNA מחקה מיקס. לאחסן את aliquots מעורב ב-80 מעלות צלזיוס.הערה: עבור כל תרביות תאים, pmol 20 של המיקס מחקה miRNA יתווסף לכל טוב (קרי, סך של 60 pmol וולס 3). כל µL 14 aliquot מותאם transfect 3 בארות של צלחת תבנית 6-ובכן, כולל 2 µL של אמצעי אחסון עודף עבור שגיאות pipetting. הכנת שבע 14 µL aliquots מספיקה להשלים מלא פיברובלסט התכנות של 3 בארות בצלחת תבנית 6-. טוב. הכנת המאגר תרביות תאים. לחמם בקבוק 500 מ”ל ו 100 מ ל בקבוק בינוני טריים מופחתת-סרום לטמפרטורת החדר (RT) כבר בערך שעתיים. אין להשתמש באמבט מים. העברת מד pH אבטחה בארון. רחץ המונה אלקטרודת זכוכית עם מים ללא נוקלאז. לכייל מד pH בהתאם להוראות ייצור. לשטוף את האלקטרודה שוב במים נטולי נוקלאז. להעביר שני הבקבוקים של מדיום מופחת-סרום לתוך ארון אבטחה. להשתמש את בקבוק 500 מ”ל RT כדי להתאים את ה-pH. למדוד רמת ה-pH בסיסי של המדיום סרום מופחתת על ידי החדרת אלקטרודת זכוכית של מד pH לתוך המאגר. לחכות עד 1 דקות לפני קריאת ה-pH על המונה. להוסיף 3-4 מ ל 1 M NaOH 500 מ”ל של מדיום מופחת-סרום, לסגור את הבקבוק, ומערבבים היטב. להמתין עד 5 דקות לפני פתיחת הבקבוק למדידה pH. הכנס האלקטרודה של מד pH לתוך המאגר והמתן עד הקריאה במד pH מייצבת. המשך להוסיף כרכים קטנים של 1 M NaOH עד ה-pH של מדיום מופחת-סרום מגיע 8.15-8.17. לכייל מד pH מספר פעמים במהלך התהליך. אם בשלב כלשהו הופך ה-pH גבוה יותר מאשר 8.18, הפחת את-ידי הוספת מדיום מופחת-סרום טריים מהבקבוק ומחוממת מראש 100 מ ל (שלב 1.3.1).הערה: ה-pH של המאגר מופחתת-סרום המבוסס על בינוני תקנים הוא קריטי. התכנות תהיה מוצלחת אם ה-pH של המאגר תרביות תאים הוא כ 8.2 ± 0.05 אבל עשוי להיכשל אם ה-pH הוא גבוה יותר מאשר 8.25. לכן, מומלץ כדי להפסיק את הוספת NaOH, ברגע pH של המאגר מגיע 8.15-8.17. פעולה זו תבטיח כי רמת ה-pH הסופי של המאגר תרביות תאים הוא כ 8.2-8.22 לאחר עיקור. מסנן לעקר את המאגר תרביות תאים באמצעות מערכת סינון ואקום 0.22 מיקרומטר. Aliquot מאגר סטיריליים אל תוך 5-15 מ ל צינורות עם המרחב האווירי מינימלי. חנות aliquots של המאגר תרביות תאים עד 3 חודשים ב 4 º C. למדוד את רמת החומציות של aliquots מעת לעת. למחוק את aliquots אם ה-pH גבוה יותר מאשר 8.25. להגביל את השימוש aliquot כדי 2 transfections רק מאז החשיפה של המאגר תרביות תאים אוויר אטמוספרי מגביר את ה-pH של המאגר. להכין המדיום הרחבה פיברובלסט (FEM): בינוני חיוני המינימלית בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 1 x 1 x עט/דלקת/fungizone 55 מיקרומטר מרקפטואתנול, תוספת גלוטמין x 1, חומצות אמינו שאינן הכרחיות. חנות ה – FEM ב 4 º C. להכין המדיום התיכנות: DMEM/F12 (אין HEPES) בתוספת 20% נוקאאוט סרום חלופי (KOSR), 0.5 x חומצות אמינו שאינן הכרחיות תוספת גלוטמין x 0.5 מיקרומטר 55 מרקפטואתנול, 50 חומצה אסקורבית µg/mL, 1 x עט/דלקת/fungizone, bFGF 100 ננוגרם למ”ל , ו- 200 ng/mL B18R. להכין את המדיום ביוזמתו של התכנות ללא bFGF, B18R, ואחסן אותו ב 4 º C. אין להשתמש זה מעבר חודש שלם לאחר ההכנה. להוסיף bFGF ו- B18R מיד לפני כל שימוש aliquot בגודל לשימוש של אותו יום. להכין המדיום ציפוי על-ידי הוספת 5% חום-לא פעיל (איץ ‘ אי) FBS לתוך התיכנות האמצעי המכיל 20% KOSR ללא bFGF B18R מהשלב 1.5. הכינו את טרי בינוני ביום של השימוש המיועד. הוסף את bFGF ואת B18R מיד לפני השימוש ביום 0 של התכנות. כיילו את חממות תרביות רקמה לפני ביצוע התכנות לפי הוראות היצרן באמצעות מנתח2 CO כף יד דיגיטלי. השתמש של חממה נמוך-O2 עבור הצעדים התיכנות כדי להבטיח דור iPSC מוצלחת. 2. culturing Fibroblasts עבור התכנות להכין fibroblasts לפני אתחול של התכנות (יום-2). המעיל צלחת חדשה של תרביות רקמה 10 ס מ 5 מ של 0.1% ג’לטין. הקש או מערבולת את הצלחת על מנת להבטיח כי השטח כולו מצופה. תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C. האחות הג’לטין ולהוסיף 10 מ”ל של ערכת FEM. הצידה. אל תאפשר המשטח מצופה של צלחת להתייבש לפני הוספת FEM. בזהירות תשאף האמצעי בילה fibroblasts. יש לשטוף את התאים פעם אחת עם 5 מ של DPBS כדי להסיר את הנסיוב שיורית. להוסיף 3 מ”ל של טריפסין-EDTA. רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח כיסוי מלא על התאים. לשאוב נוזל עודף, עוזב ~ 500 µL של טריפסין. לא תשאף יתר על המידה, שכן זה יכול לייבש ולהרוג את fibroblasts. דגירה של fibroblasts עם טריפסין-EDTA למשך 3 דקות ב 37 º C. הסר את הלוחית של החממה והקש בחוזקה אך בעדינות את הצד של הצלחת להוציא את התאים. בדוק את התאים במיקרוסקופ. אם התאים נמצאים תלוש וחסר צף, המשך. אם התאים עדיין מחוברים, תקופת דגירה של עוד 3 דקות. במהירות שטיפה/לאסוף התאים מנותקים באמצעות 5 מיליליטר פמ לנטרל את טריפסין-EDTA. הזז את המתלים פיברובלסט לתוך צינור חרוטי 15 מ”ל. ודא כי התאים נמצאים מעורבב היטב. מערבבים בעדינות התליה תא לפרוץ גושים גדולים של תאים, ואז לספור אותם על hemocytometer. העברת 2.5 10×5 תאים לתוך המנה ס מ-10 מצופים ג’לטין מוכן בשלב 2.1.1. דגירה התאים לילה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 תרביות רקמה רגילה humidified חממה.הערה: צפיפות תא הוא קריטי להשגת יעילות התיכנות גבוהה, כמו זה חשוב כי fibroblasts הם במהירות חלוקת ובריאה. ציפוי 2.5 10×5 תאים התשואות confluency 40-60% 2 ימים מאוחר יותר עבור רוב דגימות פיברובלסט. לשנות את הכמות בהתאם עבור תאים נגועים או senescent להשיג את confluency הרצוי 40-60% 48 שעות מאוחר יותר. החלף את המדיום 10 מ”ל של פמ טריים למחרת (יום-1). צלחת את fibroblasts ליזום התכנות (יום 0). ודא fibroblasts כדי לתכנת ב- 40-60% confluency (איור 2, יום 0). אם התאים נמצאים מעל או מתחת confluent, המעבר fibroblasts כפי שמתואר בשלב 2.1 ולהתאים את צפיפות ציפוי בהתאם. תרבות לעוד יומיים. העברה מ 4 ל DPBS לתוך צינור חרוטי 15 מ”ל. להוסיף 100 µL של האדם רקומביננטי (rh) laminin-521. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ביסודיות. להוסיף 1 מ”ל לכל טוב של rhLaminin מדולל-521 לתוך בארות 3 של צלחת 6-. טוב. דגירה לצלחת מצופה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לחמם 6 מ של פמ ו- 4 מ של ציפוי בינוני עד 37 מעלות צלזיוס. תוספת המדיום ציפוי עם bFGF כדי ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ”ל, B18R כדי ריכוז סופי של 200 ng/mL. בזהירות תשאף האמצעי בילה fibroblasts (שלב 2.2.1). לשטוף את התאים עם 5 מ של DPBS ולהוסיף 3 מ”ל של טריפסין-EDTA. רוק בעדינות את הצלחת כדי לכסות את התאים עם טריפסין-EDTA. האחות עודפי הנוזלים, עוזב ~ 500 µL של טריפסין, כפי שנעשה צעד 2.1.3. דגירה של fibroblasts עם טריפסין-EDTA למשך 3 דקות ב 37 º C. הסר את הלוחית של החממה והקש בחוזקה אך בעדינות את הצד של צלחת מכך התאים. בדוק את התאים במיקרוסקופ. אם התאים נמצאים תלוש וחסר צף, המשך. אם התאים עדיין מחוברים, תקופת דגירה של עוד 3 דקות. שטיפה/לאסוף התאים מנותקים באמצעות 5 מיליליטר פמ לנטרל את טריפסין-EDTA. הזז את המתלים פיברובלסט לתוך צינור חרוטי 15 מ”ל. ודא כי התאים הם מעורבים היטב ולא לסמוך עליהם hemocytometer. פיפטה 12,000 תאים לתוך 4 מ של ציפוי prewarmed בינונית משלב 2.2.4.הערה: לא centrifuge את התאים בשלב כלשהו. ניתן להתאים את מספר התאים מצופה למעלה או למטה כנדרש לקווים או מהיר-הגדלים לאט, בהתאמה. הסר את לוחית מצופה של החממה, האחות rhLaminin מדולל-521 מן הבארות מצופה. אל תאפשר את פני השטח של הבארות להתייבש. Resuspend בעדינות תאים המדיום ציפוי. פיפטה 1 מ”ל של השעיה תא לתוך כל מצופה היטב (קרי, 3,000 תאים לכל טוב). למקם את התאים מצופה חממה תרביות רקמה tri-גז עם O2 מוגדר כ- 5% (נמוך-או2). לאחר הצלחת מוגדר, בעדינות אך ביסודיות לפזר תאים, לסירוגין בין תנועה למעלה/למטה ואז שמאלה/ימינה. חזור על הרמזים 2 פעמים נוספות. דגירה התאים בן לילה. לא מערבולת את הצלחת לערבב. פיפטה 4 מ של התכנות בינוניים עד צינור חרוטי 15 מ”ל ולמקם אותו בחממה נמוך-O2 עם כובע loosened כדי equilibrate בין לילה. אל תוסיף bFGF ו- B18R עד למחרת היום. 3. ייזום של Reprogramming (יום 1) הערה: לאחר התיכנות מאותחלת, תחזוקה יומית נדרשת במשך בערך חודש. הקפד לתכנן בהתאם. Incubations תא עוקבות כל חייב להתבצע בתנאים נמוך-O2 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 humidified tri-גז חממה תרביות רקמה. החלף את המדיום ציפוי לפחות 1 שעה לפני תרביות תאים. הסר את המדיום התיכנות equilibrated החממה נמוך-או2 . להוסיף bFGF ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ”ל ו B18R כדי ריכוז סופי של 200 ng/mL. מערבבים היטב. בהליך עם 1 טוב בכל פעם, השתמש פיפטה 1 מ”ל להסיר את המדיום בילה ולהחליף אותו עם 1 מ”ל של מדיום התיכנות בתוספת bFGF ו- B18R. חזור על הפעולה עבור כל טוב. אל תשתמש השאיפה ואקום, אשר יתר על המידה מתייבש התאים לנסיון, מפחית את יעילות התיכנות. להעביר לצלחת עם תאים בחזרה לתוך החממה נמוך-או2 . Transfect fibroblasts עם 5 µL של ריאגנט תרביות תאים RNAiMax לכל 1 µg של mRNA שונה, µL 1 מהתרכובת תרביות תאים לכל pmol 6 של miRNA מחקה לפי תקנים.הערה: תוצאות אופטימליות מתקבלים כאשר transfections המשך עבור 16 – 20 h. תרביות תאים הכימית הוא מדולל 10 x; ng/µL 100 mRNA שונה קוקטייל זה מדולל 5 x; מחקה-miRNA pmol/µL 5 לערבב הוא מדולל 8.33 x עם המאגר תרביות תאים לפני complexation. לקבלת סיכום של ההתקנה תרביות תאים, ראה טבלה 1 . בזמן הכנת תקנים מערבב, למזער חשיפה אפשרית של ריאגנטים RNase על-ידי ביצוע מעבדה סטנדרטיים. Equilibrate של aliquot של המאגר תרביות תאים (שלב 1.3) עבור 1 h RT. אין להשתמש אמבט מים 37 ° C או חממה כדי לחמם את המאגר תרביות תאים. הסרה של aliquot יחיד של ששונה mRNAs (33 µL), miRNA מחקה (14 µL) מ-80 מעלות צלזיוס לחמם אותן כדי RT למשך כ 3-5 דקות, עד הקרת. לא להפשיר את aliquots ב 37 º C. ספין אותם למטה בקצרה ב microfuge. חמים הכימית תרביות תאים כדי RT למשך כ 3-5 דקות. אל תשתמש אמבט מים 37 ° C או חממה. היפוך הצינור סגור 2 – 3 פעמים כדי לערבב הכימית. . תסובב את זה למטה לזמן קצר ב- microfuge העברת µL 279 המאגר תרביות תאים RT לתוך צינור microcentrifuge נטולת RNase. להוסיף µL 31 מהתרכובת תרביות תאים כדי להשיג נפח סופי של µL 310. לערבב ביסודיות על ידי pipetting. לא מערבולת. דגירה הצינור ב RT עבור 1 דקות.הערה: אמצעי אחסון זה מהתרכובת מדולל תרביות תאים מספיקה למתחם ששונה mRNA והן miRNA מחקה aliquots מהשלב 3.2.3. להוסיף µL 132 המאגר תרביות תאים RT aliquot 33 µL של mRNA שונה. פיפטה בעדינות לערבב: אחסון הסופי הוא 165 µL. להוסיף µL 102.6 המאגר תרביות תאים RT aliquot 14 µL של miRNA מחקה. פיפטה בעדינות לערבב: אחסון הסופי הוא 116.6 µL. הוסף µL 165 מהתרכובת תקנים מדולל מהשלב 3.2.5 כדי מדוללת mRNA שונה שלב 3.2.6. פיפטה לערבב: אחסון הסופי הוא 330 µL. הוסף µL 116.6 מהתרכובת תקנים מדולל מהשלב 3.2.5 לתערובת מחקה miRNA מדולל מהשלב 3.2.7. מערבבים היטב (נפח סופי הוא 233.2 µL). תקופת דגירה של 15 דקות ב RT כדי לאפשר המאגר תרביות תאים למתחם עם mRNAs שונה, miRNA מחקה. הסר את הלוחית עם תאים של החממה נמוך-או2 . להוסיף 100 µL (1 µg) של מורכבות שונה mRNA תרביות תאים שילוב כל טוב, dropwise על פני הבאר. לפזר את מתחמי תרביות תאים על-ידי בעדינות אך ביסודיות לזעזע את הצלחת עם תנועה למעלה/למטה ואז שמאלה/ימינה. לא מערבולת את הצלחת לערבב. להוסיף 66.7 µL (20 pmol) של המיקס של תרביות תאים מחקה miRNA ומורכבת מכל קידוח, dropwise על פני הבאר. לפזר מתחמי תרביות תאים על-ידי בעדינות אך ביסודיות לזעזע את הצלחת עם תנועה למעלה/למטה ואז שמאלה/ימינה. לא מערבולת את הצלחת לערבב. למקם את התאים transfected tri-גז החממה ב- O2 מוגדר כ- 5% (נמוך-או2). לאחר הצלחת מוגדר, לפזר את מתחמי תרביות תאים שוב על ידי בעדינות אך ביסודיות לזעזע את הצלחת עם תנועה למעלה/למטה ואז שמאלה/ימינה. פיפטה 4 מ של התכנות בינוני לתוך צינור חרוטי 15 מ”ל ולמקם אותו בחממה נמוך-O2 עם כובע התיר equilibrate בין לילה. אל תוסיף bFGF ו- B18R עד למחרת היום. צינור 1 – דילול RNAiMax (1רחוב mix) מגיב ריכוז נפח מאגר תרביות תאים 279 ΜL RNAiMax (להוסיף 2) 10 x 31 ΜL סה כ: µL 310 (דגירה 1 דקות בטמפרטורת החדר) צינור 2 – mRNA שונה לערבב (2nd mix) מגיב ריכוז נפח מיקס mRNA שונה 100 ng/µL (5 x) 33 ΜL מאגר תרביות תאים 132 ΜL סה כ: µL 165 (להוסיף נפח שווה RNAiMax מדולל צינור 1) צינור 3 – miRNA מחקה לערבב (3rd mix) מגיב ריכוז נפח miRNA מחקה מיקס 5 pmol/µL (8.33 x) 14 ΜL מאגר תרביות תאים 102.6 ΜL סה כ: µL 116.6 (להוסיף נפח שווה RNAiMax מדולל צינור 1) טבלה 1: הכנת תערובת תרביות תאים. 4. החלפת Reprogramming בינוני בין Transfections (ימים 2, 4, 6, 8, 10 ו- 12) החלף את בינוני 16 – 20 h תקנים שלאחר כמתואר ב- 3.1.1–3.1.2. להוסיף bFGF ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ”ל ו B18R כדי ריכוז סופי של 200 ng/mL לתוך התיכנות aliquots בינונית. לפקח על הביטוי mWasabi מדי יום כדי לוודא איכות תרביות תאים באמצעות מיקרוסקופ נקבעה לדמיין EGFP.הערה: ביטוי mWasabi צריכה להיות מינימלית לכאורה ביום 2 ולאחר לודיג בהירות עם כל תרביות תאים נוספים. 5. כל אחר-יום Transfections (ימים 3, 5, 7, 9, 11 ו- 13) לבצע תרביות תאים כפי שמתואר בשלב 3.2. אל תשנה את המדיום בימים של תרביות תאים. להכין aliquot 4 מ”ל של התכנות בינוני ומניחים אותו בחממה נמוך-O2 כדי equilibrate לשינוי בינוני למחרת היום. אל תוסיף bFGF ו- B18R עד למחרת היום. 6. נהלים שיש לבצע לאחר גמר תרביות תאים לבצע שינויים בינונית מדי יום מיום 14 דרך כ יום 17. לחמם 7 מ של התכנות בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס. להוסיף bFGF ריכוז סופי של 100 ננוגרם למ”ל.הערה: B18R כבר לא נחוץ לאחר תרביות תאים הסופי. מעבר יום 14, זה כבר לא הכרחי כדי equilibrate בין לילה המדיום בחממה נמוך-O2 . הסר את המדיום של כל הבארות באמצעות פיפטה סרולוגית. להמשיך להימנע משימוש השאיפה. להוסיף 2 מ של התכנות בינוני בתוספת bFGF לכל טוב. בימים 17 ו-18, לנתח את בארות reprogrammed תחת מיקרוסקופ הפוכה או ויבתר. אם המושבות נוצרות בסמיכות זו לזו בשל יעילות גבוהה של התכנות ואין אפשרות מבודד באופן ידני, להפריד את המושבות על-ידי ביצוע passaging אופציונלי של וולס היו שמתואר בשלב 7 להלן. אם המושבות הינם דליל מופרדים היטב, לבחור באופן ידני שיבוטים ישירות מ- reprogrammed טוב כפי שמתואר בשלב 8 של תת-תרבות iPSCs על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. 7. הליך אופציונלי: Passaging תאים מבארות מחדש באמצעות EDTA הכן 0.5 מ מ EDTA DPBS (EDTA) על ידי דילול הפתרון מניות של EDTA 0.5 M. מסנן לחטא EDTA באמצעות מערכת סינון ואקום 0.22 מיקרומטר. להכין pluripotent מזין ללא תאי גזע (PSC) בינונית (למשל, mTeSR1) על פי הוראות היצרן. לחמם מ 32 ל PSC בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס. מעיל כל בארות של שתי צלחות. ובכן 6 תבנית עם המלא hESC מטריצה חוץ-תאית (ECM) ההוראות של היצרן. חותם צלחות עם סרט פרפין, דגירה אותם עבור h 1-RT. וארוקן את פתרון ה-ECM של הלוחות מראש ומחוממת ולהחליף אותו עם 2 מ ל PSC בינוני לכל טוב. אל תאפשר את פני השטח של הבארות להתייבש. להגדיר אותם הצידה. האחות המדיום התיכנות מבארות היו 2 ביום כאשר המושבות וגדולים בבירור בנוי (בדרך כלל יום 18). לשטוף פעם עם 1 מ”ל של EDTA, וביופסיה. להוסיף 1 מ”ל של EDTA לכל טוב. תקופת דגירה של 4 דקות ב 37 º C. בעדינות הסר את הלוחית של החממה ולמקם אותו אבטחה בארון.הערה: בשלב זה, תאים עשוי להיות מודבקת מאוד רופף, משתחררים ממקומם בקלות. בזהירות תשאף EDTA שתי בארות. להוסיף 3 מ”ל של מדיום PSC ומחוממת מראש לכל ליחס טוב עם EDTA. השתמש של התא-מגרד בעדינות אך ביסודיות מכך התאים שניכם בארות. השתמש פיפטה סרולוגית בעדינות pipette התליה תא ולשבור את הגושים הגדולים. לא פיפטה עד כל כגיהנום תא נעלמו. לשמר iPSC אשכולות.הערה: ציפוי גושים גדולים לא תשפיע iPSC המושבה תוצר. אם יש גושים תא גדול יתר על המידה, פשוט להימנע להעביר אותם לתוך המנה הבאה. באמצעות פיפטה סרולוגית, פזר באופן שווה תאים מכל קידוח EDTA שטופלו על-ידי pipetting 0.5 mL לבאר כל צלחת 6-ובכן מצופים ECM.הערה: אל תשלבו תאים מן הבארות reprogrammed (קרי, היו גם 1 צריך להיות מופץ באופן שווה לתוך צלחת 6-הבאר הראשונה, היו 2 טוב יופצו באופן שווה 6-ובכן המשקולת השני). העבר את התאים מצופה בחזרה לתוך החממה נמוך-או2 . לפיזור אחיד תאים, מנערים כל צלחת הגב וושוב, צד אל צד. לא מערבולת. החלף את המדיום PSC מדי יום. 8. איסוף iPSC המושבות לחמם-15 מיליליטר PSC בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס. מעיל כל בארות של לוח 6-ובכן אחד עם ה-ECM המלא hESC ההוראות של היצרן. לאטום את הצלחות עם סרט פרפין, דגירה אותם עבור h 1-RT. האחות המדיום תרבות מבארות בשימוש כדי לאסוף את iPSCs. לשטוף פעם עם 1 מ”ל של EDTA, וביופסיה. להוסיף 1 מ”ל של EDTA לכל טוב. תקופת דגירה של 4 דקות ב 37 º C. בעוד התאים הם המקננת, וארוקן את פתרון ה-ECM של הלוחות מראש ומחוממת והחלף 2 מ ל PSC בינוני לכל טוב. להפריש את הצלחות. הסר בעדינות לצלחת עם iPSCs כדי לבחור בהם מתוך החממה ולמקם אותו אבטחה בארון.הערה: בשלב זה, תאים עשוי להיות מודבקת מאוד רופף, משתחררים ממקומם בקלות. בזהירות תשאף EDTA. להוסיף בעדינות 3 מ”ל של מדיום PSC מראש ומחוממת, מטפל לא להוציא iPSC מושבות. להעביר הצלחת אל טווח הפוכה או ויבתר טוב יותר להמחיש מושבות. הכן על פיפטה 1 מ”ל עם טיפ סטרילי. את הבוכנה במלואו ולאחר מכן שימוש בקצה פיפטה יחפ מושבה בעדינות תוך כדי ציור לאט נוזל לתוך קצה כדי לאסוף את המושבה. צייר כמו בינוני קטן ככל האפשר תוך איסוף המושבה iPSC. כדי להעביר את המושבה, פיפטה למעלה ולמטה 3 – 4 פעמים לבאר בודדת של צלחת מצופים ECM מהשלב 8.2. חזור עד 6 מושבות בחרה והעבירו לתוך בארות בודדים. לבחור מושבות לא יותר מ-2 מבאר יחיד כלשהו אם אופציונלי passaging המתואר בשלב 7 בוצע. השתמש פרוטוקול סטנדרטי בתאי גזע אנושיים להקפיא את כל בארות הנותרים. להפשיר, צלחת מחדש קפוא מניות אם המושבות יותר, יש לבחור מאוחר יותר. 9. אפיון iPSCs לבצע TRA-1-60 מכתים לניתוח של התכנות יעילות (יום 18).הערה: 2 מתוך 3 בארות מחדש הם passaged עבור איסוף המושבה בעתיד. הנותרים טוב יכול לשמש עבור צביעת TRA-1-60. הליך זה יכול להתבצע על גבי ספסל מעבדה. לשטוף את reprogrammed טוב עם 1 מ”ל ל- PBS. לתקן תאים עם מתנול כקרח ב-20 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. וביופסיה מתנול. יבש הבאר עבור 2 דק יש להיזהר לא יבש מדי. התאים התייבשו מספיק כאשר הם הופכים צבע שקוף/מט. לשטוף היטב 3 פעמים עם 1 מ”ל של PBS במשך חמש דקות עם טלטול עדין. במהלך מנקי, להכין 3 מ ל מי חמצן 3% ב- PBS. מחוק לגמרי מגניב. להוסיף 2 מ ל תמיסה מדוללת. תקופת דגירה של 15 דקות ב RT ברעידות עדין. להכין 4 מ”ל של הפתרון חסימה: 10% שור-אלבומין (BSA) ב- PBS. האחות של תמיסה. לשטוף היטב 2 פעמים עם 1 מ”ל של PBS במשך 5 דקות. האחות PBS ולהוסיף 2 מ”ל של חסימת פתרון לתוך הבאר. תקופת דגירה של h 1-RT. לשטוף היטב 3 פעמים עם 1 מ”ל של PBS במשך חמש דקות עם טלטול עדין. לדלל העיקרי נוגדן anti-TRA-1-60-מטריים בפתרון חסימה בתוספת אזיד הנתרן 0.05%. להכין 1 מ”ל של דילול נוגדנים עבור 1 טוב של כל תבשיל תבנית 6-. טוב. מוסיפים נוגדן דילול הבאר, לעטוף את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע התאיידות. דגירה בין לילה ב 4 ° C עם טלטול עדין.הערה: אם יש צורך, הדגירה עם נוגדן ראשוני יכול להיעשות עבור h 1 ב RT ברעידות עדין. דילול נוגדן ראשוני ניתן מחדש עד 5 פעמים. לאחר דגירה עם נוגדן ראשוני, לשטוף היטב 3 פעמים עם 1 מ”ל של PBS במשך חמש דקות עם טלטול עדין. לדלל משני העכבר אנטי מצומדת HRP הנוגדן-1:200 בפתרון חסימה. דגירה הבאר עם דילול נוגדנים משניים עבור 2 h ב- RT ברעידות עדין. האחות דילול נוגדנים משניים ולשטוף היטב 3 פעמים עם 1 מ”ל של PBS במשך חמש דקות עם טלטול עדין. במהלך לשטוף את השלישי, להכין את הפתרון המצע בעקבות ההוראה של היצרן. לאחר השטיפה הסופית האחות PBS. להוסיף 1 מ”ל של הפתרון המצע, דגירה עד בצבע הרצוי מפתחת (כ- 10 דקות). האחות הפתרון המצע. לשטוף היטב עם מים במשך 5 דקות תוך כדי טלטול בעדינות. לספור את המושבות, אם רצונך בכך. התכנות יעילות = (מספר מושבות) / (מספר של מצופים fibroblasts) x 100%. לאחסון לטווח ארוך, תשאף מים מהצלחת ויטראז’ים ולאחר מילה נהדרת בין לילה-RT. חותם לצלחת מיובשים עם מצלמות-מיקרוסקופים ולאחסן ב 4 ° C עד 2 שנים להעריך את יעילות התיכנות מאוחר יותר.