RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

RNase フリーの条件の下で働くし、可能な場合の無菌技術を使用します。生物学的安全キャビネットの無菌技術を使用してのすべての細胞培養関連操作を実行します。ひと細胞での仕事のため制度的バイオ標準に続きます。 1. 試薬および開始をリプログラミングの準備のための機器 変更された mRNA にエンコードの初期化因子カクテルを準備します。 In vitro転写、キャッピングを行い個々 のリプログラミング因子ごとの変更された mRNA の手順を dephosphorylation10以前に公開されたプロトコルに従ってください。最終的な浄化のステップの後ヌクレアーゼ フリー水で変更された mRNA を溶出、1 U/μ L RNase 阻害剤と精製された mRNA ソリューションを補完、分光光度計を使用して修正された Mrna を量的に表わす、-80 ° C で 6 ヶ月保存します。凍結融解サイクルの数を最小限に抑えるためにそれぞれ変更された mRNA の複数の因数を準備します。注: 変更された mrna 生産がされている類似したプロトコルは別途5,8,11報告。生体外のトランスクリプションのためのテンプレートは、10以前に公開されたプロトコルに従って材料の表に記載されているプライマーを使用して対応するプラスミッドのテンプレートから pcr によって生成できます。各リプログラミング因子のプラスミッドのテンプレート (M3O9SOX2、KLF4、cMYC、NANOG、LIN28A)、mWasabi (transfection のためコントロール) は Addgene、非営利のプラスミッドのリポジトリで利用。 一緒に 3:1:1:1:1:1 のモル比で変更されたすべての Mrna を混合 (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) 10% を含めると mWasabi は、トランスフェクション効率のコントロールとして mRNA を変更します。1 U/μ L RNase 阻害剤を添加したヌクレアーゼ フリー水を追加することにより 100 ng/μ L の最終的な集中にミックスをリプログラミング完全な変更された mRNA の濃度を調整します。7 準備完全の 33 μ 因数変更 mRNA カクテル。混合のリプログラミング因数-80 ° C で保存します。注: 各の transfection のため 1,000 ウェルあたり変更された mRNA カクテルの ng が追加されます (すなわち3,000 の合計 3 井戸 ng)。各 33 μ L 分注 6 ウェル形式プレートの 3 井戸を使ってサイズし、3 μ L 分注エラーを考慮して余分なボリュームが含まれています。7 つの準備 33 μ 因数は 6 ウェル形式プレート 3 井戸のにおける線維芽細胞のリプログラミングを完了するのに十分な。 MiRNA の模倣をリプログラミングのカクテルを準備します。 凍結乾燥ディゾルブ miRNA 模倣 (Syn-が-ミール-302 a-3 p、Syn-が-ミール-302b-3 p、Syn-が-ミール-302 c-3 p、Syn-が-ミール-302d-3 p, Syn-が-ミール-367-3 p) 1 U/μ L の RNase 阻害剤を添加したヌクレアーゼ フリー水 5 pmol/μ L (5 μ M) の最終的な集中に。各 miRNA 模倣の複数の因数を準備し、長期保存-80 ° C で保存します。 5 pmol/μ L (5 μ M) の最終的な集中に 1:1:1:1:1 のモル比ですべての miRNA mimics をミックスします。7 準備 miRNA の 14 μ 因数ミックスを模倣しています。-80 ° C の混合試料を保存します。注: 各トランスフェクション (すなわち合計 3 井戸 60 pmol) ウェルあたりの miRNA mimics ミックス 20 pmol が追加されます。各 14 μ L 分注 6 ウェル形式プレートの 3 井戸を使ってサイズし、2 μ L 分注エラーを考慮して余分なボリュームが含まれています。7 つの準備 14 μ 因数は 6 ウェル形式プレート 3 井戸のにおける線維芽細胞のリプログラミングを完了するのに十分な。 遺伝子導入バッファーを準備します。 あらかじめ暖かい 500 mL ボトル 1 本と約 2 時間 (RT) 室温新鮮減少血清培地の 100 mL ボトル 1 本。水浴を使用しないでください。 バイオ セーフティ キャビネットに pH メーターを転送します。ヌクレアーゼ フリー水でメーターのガラス電極を洗います。製造元の指示に従って pH メーターを調整します。ヌクレアーゼ フリー水で再び電極を洗います。 バイオ セーフティ キャビネットに減少血清中の両方のボトルを転送します。500 ml RT を使って pH を調整します。 バッファーの pH 計のガラス電極を挿入することによって減少血清中の基本 pH を測定します。メーターに pH を読む前に 1 分を待ちます。 減少血清培地 500 mL に 1 M 水酸化ナトリウムの 3-4 mL を追加し、瓶を閉じて、よく混ぜます。PH 測定のためのびんを開く前に最大 5 分を待ちます。バッファーに pH メーターの電極を挿入し、pH メーターの読みが安定するまで待ちます。 続けて減少血清培地の pH に達する 8.15-8.17 まで 1 M NaOH の少量を追加します。処理中に数回の pH メーターを調整します。任意の時点で pH は 8.18 より高くなると、予め温めておいた 100 mL ボトル (ステップ 1.3.1) から新鮮な減少血清培地を追加することで減らします。注: 減少血清培地ベースのトランスフェクション バッファーの pH が重要です。リプログラミングは、トランスフェクション バッファーの pH は約 8.2 ± 0.05 が pH が 8.25 より高い場合が失敗する場合、成功するでしょう。したがって、バッファーの pH に達すると 8.15-8.17 NaOH の追加を停止することをお勧めします。これは、トランスフェクションのバッファーの最終 pH は滅菌後約 8.2-8.22 を保証されます。 フィルターは、0.22 μ m の真空ろ過システムを用いた遺伝子導入バッファーを殺菌します。因数空気間隔は最小限 5 や 15 mL チューブの滅菌バッファー。 4 ° C で最大 3 カ月のトランスフェクション バッファーの因数を格納します。試料の pH を定期的に測定します。PH が 8.25 より高い場合は、試料を破棄します。遺伝子導入バッファーの大気への露出増加バッファーの pH にのみ、2 transfections に分注の使用を制限します。 線維芽細胞拡張メディア (FEM) の準備: 10% 牛胎児血清 (FBS)、非本質的なアミノ酸、1 x グルタミン、55 μ M 2-メルカプトエタノール、1 x ペン/連鎖球菌/fungizone x 1 最小必須培。ストア 4 ° C で有限要素法 リプログラミングのメディアの準備: 20% ノックアウト血清交換 (KOSR)、非本質的なアミノ酸 x 0.5、0.5 x グルタミン、55 μ M 2-メルカプトエタノール、50 μ g/mL アスコルビン酸、1 x ペン/連鎖球菌/fungizone、100 ng/mL bFGF 添加 DMEM/F12 (HEPES なし)、と 200 ng/mL B18R。BFGF と B18R、なしリプログラミングの開始時のメディアの準備、4 ° C で保存1 月の翌月の準備を越えてそれを使わない。各使用の直前にその日使用するため大きさを因数に bFGF と B18R を追加します。 5% 熱不活化 (HI) 20% を含有するリプログラミング媒質に FBS を追加してめっきメディアの準備 bFGF と手順 1.5 から B18R なし KOSR。当日使用目的の中の新鮮なを準備します。リプログラミングの 0 日目に使用直前に bFGF と B18R を追加します。 ハンドヘルド デジタル CO2アナライザーを使用して、製造元の指示に従って初期化を開始する前に、組織文化のインキュベーターを調整します。確実に成功 iPSC 生成低 O2インキュベーター プログラムし直す手順を使用します。 2. リプログラミングの線維芽細胞を培養 線維芽細胞リプログラミング (日-2) の開始前に準備をします。 5 ml の 0.1% ゼラチンの新しい 10 cm 組織培養プレートをコートします。タップまたは全体の表面をコーティングすることを確保するためプレートを旋回します。37 ° C で 15 分間インキュベートします。ゼラチンを吸引し、有限要素法セット脇 10 mL を追加します。有限要素法を追加する前に乾燥するプレートの塗装面を許可しません。 慎重に、繊維芽細胞から使用済み培地を吸引します。残留の血清を削除する DPBS 5 mL で一度セルをすすいでください。トリプシン-EDTA の 3 mL を加えます。セルを介して完全なカバレッジを確保するためプレートがみ合います。 トリプシンの 〜 500 μ L を残し、余分な水分を吸引します。過剰を吸い出してはいけない、これは乾燥し、繊維芽細胞を殺すことができます。トリプシン-EDTA 37 ° C で 3 分間で線維芽細胞を孵化させなさい インキュベーターからプレートを削除し、しっかり、でも優しく、細胞を取り除くためプレートの側面をタップします。顕微鏡下で細胞を確認します。セルは戸建とフローティング、進みます。セルがまだ接続されている場合は、別の 3 分間インキュベートします。 すぐにリンス/収集トリプシン-EDTA を中和するために有限要素法の 5 mL を使用して剥離細胞。線維芽細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に移動します。細胞が十分に混合されたことを確認します。 細胞の大きな塊を破るし、診断上それらを数える細胞懸濁液を軽く混ぜます。2.1.1 準備したゼラチン コーティング 10 cm 皿に転送 2.5 x 105細胞。37 ° C、5% CO2加湿の定期的培養インキュベーターで一晩細胞を孵化させなさい。注: セル密度、リプログラミング効率を達成するために重要な繊維芽細胞が急速に割ると健康的なことが重要です。5セル 2.5 x 10 をメッキ線維芽細胞のほとんどのサンプルの後で 2 日間 40-60% の confluency が得られます。それに応じて量を調整する目的の 40-60% の confluency 後 48 h を達成するために病気や老化細胞の。 培地 10 mL の新鮮な有限要素法の翌日 (日-1) に置き換えます。 (0 日目) のリプログラミングを開始する線維芽細胞をプレートします。 40-60% の confluency (図 2は、0 日目) に再プログラムする線維芽細胞があることを確認します。セルの上または下の合流場合、手順 2.1 で繊維芽細胞を通過し、メッキ密度を調整します。別の 2 日間の文化。 DPBS 4 mL を 15 mL の円錐管に転送します。リコンビナントヒト (rh) ラミニン 521 の 100 μ L を追加します。ピペットの上下に混和します。 6 ウェル プレートの 3 井戸に希釈 rhLaminin 521 の井戸あたり 1 ml を追加します。2 h の 37 ° C でコーティングされたプレートを孵化させなさい。 有限要素法の 6 mL、4 mL 播種培地を 37 ° C の暖かい100 ng/mL の最終的な集中に bFGF と 200 ng/mL の最終的な集中に B18R メッキ媒体を補足します。 慎重に線維芽細胞 (ステップ 2.2.1) から使用済み培地を吸引します。リンスの DPBS の 5 mL の細胞とトリプシン-EDTA の 3 mL を加えます。優しくロック トリプシン-EDTA とセルをカバーするプレート。 2.1.3 のステップで実行、トリプシンの 〜 500 μ L のまま、余分な水分を吸引します。トリプシン-EDTA 37 ° C で 3 分間で線維芽細胞を孵化させなさいインキュベーターからプレートを削除し、しっかり、でも優しく細胞を取り除くためプレートの側面をタップします。顕微鏡下で細胞を確認します。セルは戸建とフローティング、進みます。セルがまだ接続されている場合は、別の 3 分間インキュベートします。 リンス/トリプシン-EDTA を中和するために有限要素法の 5 mL を使用して剥離細胞を収集します。線維芽細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に移動します。セルが十分に混合された診断にそれらを数えることを確認します。2.2.4 のステップから prewarmed めっき中の 4 mL ピペット 12,000 セル。注: はない任意の時点で細胞を遠心分離機します。めっきされたセルの数を調整することができますアップまたはそれぞれまたは高速-成長の遅いラインに必要なダウンします。 インキュベーターからコーティングのプレートを外し、コーティングされた井戸から希釈 rhLaminin 521 を吸引します。乾燥する井戸の表面は認めません。優しくめっき培地で細胞を再懸濁します。各コーティングに細胞懸濁液の 1 mL をピペットも (すなわち3,000/ウェルの細胞)。 O2 5% (低 O2) に設定、トライ ガス培養孵卵器にめっきされたセルを配置します。板を設定すると、やさしく、徹底的にはアップ/ダウン、左/右の動きを交互細胞を分散します。モーション 2 回を繰り返します。セルを一晩インキュベートします。ミックス プレートは旋回しません。 15 mL の円錐管に媒体をリプログラミングの 4 mL をピペット、一晩平衡に緩めたキャップ低 O2インキュベーター内に置きます。次の日まで bFGF と B18R を追加することはできません。 3. リプログラミング (1 日目) の開始 注: 書き換えが開始されると、日常のメンテナンスは、必要な約 1 ヶ月です。それに応じて計画してください。すべてのそれに続くセル孵化は 37 ° C、5% CO25% O2加湿トライ ガス培養インキュベーター低 O2条件下で行う必要があります。 めっき中少なくとも 1 トランスフェクション前に h を交換してください。 低-O2インキュベーターから平衡リプログラミング メディアを削除します。200 ng/mL の最終的な集中に 100 ng/mL と B18R の最終的な集中に bFGF を追加します。よく混ぜます。 1 一度にうまく進める、使用済み培地を取り除き、1 ml のリプログラミング培 bFGF と B18R の交換に 1 mL ピペットを使用します。各ウェルにこれを繰り返します。過度に細胞を乾燥、ストレスを引き起こし、リプログラミング効率が低下、真空吸引を使用しないでください。セル板を低-O2インキュベーターに戻します。 RNAiMax トランスフェクション試薬変更された mRNA の 1 μ g あたりの 5 μ L で線維芽細胞を transfect、トランスフェクションあたり 1 μ L あたり 6 pmol miRNA のトランスフェクション試薬の模倣します。注: transfections が 16-20 h に進むときに最適な結果が得られます。トランスフェクション試薬が希釈 10 x;100 ng/μ L が変更された mRNA カクテルは希釈 5 x;ミックスは 5 pmol/μ L miRNA mimics 希釈錯形成する前に遺伝子導入バッファーと 8.33 x。トランスフェクションのセットアップの概要については表 1を参照してください。 ミックス、トランスフェクションを準備する試薬の RNase に対する潜在的な標準的な実験室の練習に従うことによって最小限に抑えます。 室温約 1 h のトランスフェクション バッファー (手順 1.3) の因数を平衡します。遺伝子導入バッファーを暖めるは 37 ° C の水浴やインキュベーターを含めないでください。 変更された Mrna (33 μ L) の 1 つの因数を取り外し、miRNA は-80 ° C から (14 μ L) を模倣し、解凍まで約 3-5 分の RT にそれらを暖めます。37 ° C で因数で解凍しないでください。それらをスピンを簡単に、および microfuge の。 約 3-5 分の RT にトランスフェクション試薬を温めます。37 ° C の水浴やインキュベーターを使用しないでください。2-3 回閉鎖チューブを反転、試薬を混合します。それでスピンダウンすると簡潔に、および microfuge。 RNase フリーの遠心管に 279 μ RT トランスフェクション バッファーを転送します。31 μ l 添加 310 μ L の最終巻を達成するためにトランスフェクション試薬のピペッティングで徹底的にミックス。ボルテックスにかけないでください。1 分の RT でチューブを孵化させなさい。注: この希薄トランスフェクション試薬量は複雑な十分な変更された mRNA および miRNA の両方を模倣ステップ 3.2.3 から因数。 変更された mRNA の 33 μ 因数に RT トランスフェクション バッファーの 132 μ L を追加します。軽く混ぜてピペット: 最終巻は 165 μ L。 MiRNA の模倣の 14 μ 因数に RT トランスフェクション バッファーの 102.6 μ L を追加します。軽く混ぜてピペット: 最終巻は 116.6 μ L。 165 μ L 希釈するステップ 3.2.5 から希薄化後のトランスフェクション試薬の 3.2.6 のステップからの mRNA の変更を追加します。ミックスするピペット: 最終巻は 330 μ L。 3.2.5 のステップからステップ 3.2.7 から希釈した miRNA mimics ミックスに 116.6 μ L 希釈トランスフェクション試薬を追加します。よく混ぜる (最終巻は 233.2 μ L)。変更された Mrna と複雑なトランスフェクション バッファーを許可する常温 15 分間インキュベートし、miRNA を模倣します。 低-O2インキュベーターから細胞をプレートを取り外します。100 μ L (1 μ g)、複合の変更各ウェルに mRNA トランスフェクション ミックス滴下井戸全体を追加します。徹底的に攪拌し、アップ/ダウン、左/右の動きと板が軽くによるトランスフェクション錯体を分散させます。ミックス プレートは旋回しません。 追加 66.7 μ L (20 pmol) 複合 miRNA mimics トランスフェクション ミックスの各ウェルに滴下、だけに。徹底的に攪拌し、アップ/ダウン、左/右の動きと板が軽くトランスフェクション錯体を分散させます。ミックス プレートは旋回しません。 O2 5% (低 O2) に設定、トライ ガス インキュベーターに transfected セルを配置します。板を設定すると、一度分散トランスフェクション錯体再び優しく徹底的に攪拌し、アップ/ダウン、左/右の動きと板が。 15 mL の円錐管に媒体をプログラムし直すの 4 mL をピペット、一晩平衡に緩めたキャップ低 O2インキュベーター内に置きます。次の日まで bFGF と B18R を追加することはできません。 管 1 – RNAiMax 希釈 (1 ミックス) 試薬 濃度 ボリューム 遺伝子導入バッファー 279 Μ L RNAiMax (追加 2) 10 倍 31 Μ L 合計: 310 μ L (1 分室温で孵化させなさい) 管 2 – 変更された mRNA ミックス (2 ミックス) 試薬 濃度 ボリューム 変更された mRNA ミックス 100 ng/μ l (5 x) 33 Μ L 遺伝子導入バッファー 132 Μ L 合計: 165 μ L (チューブ 1 から希釈 RNAiMax の等量を追加) チューブ 3 – miRNA mimics ミックス (3 ミックス) 試薬 濃度 ボリューム miRNA 模倣ミックス 5 pmol/μ L (8.33 x) 14 Μ L 遺伝子導入バッファー 102.6 Μ L 合計: 116.6 μ L (チューブ 1 から希釈 RNAiMax の等量を追加) 表 1: トランスフェクション ミックスの準備。 4. Transfections の間にリプログラミング媒体を交換 (2、4、6、8、10、12 日間) 3.1.1–3.1.2 で説明したように中 16-20 h 後トランスフェクションを置き換えます。リプログラミング中因数に 200 ng/mL の最終的な集中に 100 ng/mL と B18R の最終的な集中に bFGF を追加します。 EGFP を視覚化する構成されている顕微鏡を用いた遺伝子導入品質を確認するには、mWasabi 式毎日を監視します。注: mWasabi 式に最低限 2 日目に判明、各追加のトランスフェクションと明るさを増します。 5-その他-毎日 Transfections (3、5、7、9、11、13 日間) 3.2 で説明されているように、トランスフェクションを実行します。トランスフェクションの日に媒体を変更しないでください。 媒体をリプログラミングの 4 mL の約数を準備し、次の日に中型の変更の平衡に低 O2インキュベーター。次の日まで bFGF と B18R を追加することはできません。 6. 最終的なトランスフェクション後に実行する手順 約から 14 日目まで毎日媒体変更を実行 17 日目。7 mL の培地を 37 ° C をプログラムし直すを暖かく100 ng/mL の最終的な集中に bFGF を追加します。注: B18R は最終的なトランスフェクション後必要なもはやです。14 日を超えてもはや低 O2インキュベーターで一晩中を平衡に必要としてます。 血清ピペットを使用してすべての井戸からメディアを削除します。吸引を使用してを回避し続けます。ウェルあたり bFGF 培をリプログラミングの 2 mL を追加します。 17 日と 18 日に反転または解剖顕微鏡の下でプログラムし直された井戸を分析します。コロニーがリプログラミングの高効率化のため互いに近接で形成され、手動で分離することはできない場合は、手順 7 の次に記載されているプログラムし直された井戸のオプション継を実行して植民地を区切ります。植民地もまばらですし十分に分離はステップ 8 および標準のプロトコルによるとサブカルチャー Ips の説明同様に手動で、プログラムし直されたから直接クローンを選択します。 7. オプションの手順: 継 EDTA を用いた再観測井戸からの細胞 0.5 M EDTA 原液を希釈して 0.5 mM EDTA DPBS (EDTA) を準備します。フィルターは、0.22 μ m の真空ろ過システムを使用して EDTA を殺菌します。 製造元の指示に従ってフィーダー無料多能性幹細胞 (PSC) 媒体 (例えばmTeSR1) を準備します。37 ° c. に PSC 媒体の事前暖かい 32 mL 製造元の指示に従って hESC 修飾の細胞外マトリックス (ECM) と 2 つの 6 形式プレートのすべての井戸をコートします。パラフィン フィルム プレートを密封し、室温 1 時間それらを孵化させなさい 予め温めておいたプレートから ECM ソリューションを吸引し、ウェルあたり PSC 培地 2 mL に置き換えます。乾燥する井戸の表面は認めません。わきに置きます。 植民地が広いと明確に形成されたときの日 2 プログラムし直された井戸からリプログラミング培地を吸引 (通常 18 日)。EDTA と吸引 1 mL で 1 回すすぎます。 ウェルあたり EDTA の 1 mL を追加します。37 ° C で 4 分間インキュベートします。 優しくインキュベーターからプレートを削除し、キャビネット、バイオ セーフティにおけるそれを配置します。注: この時点で、セル可能性があります非常に緩く付着と簡単に外れてしまい。 慎重に両方の井戸から EDTA を吸い出しなさい。EDTA と同様に予め温めておいた PSC 媒体の 3 mL を追加します。優しくは徹底的に両方の井戸から細胞を取り除くため細胞スクレーパーを使用します。 血清ピペットを使用して、優しく細胞懸濁液をピペットし、大きな塊を分割します。すべての細胞の塊がなくなるまではピペットないです。IPSC クラスターを保持します。注: 大きな塊をメッキしても iPSC コロニー伸長、与えません。極端に大きな細胞塊が存在する場合は、単に次の料理にそれらを転送を避けます。 血清ピペットを使用して、各 EDTA 処理井戸から細胞の細胞外マトリックス コート 6 ウェル プレートの各ウェルに均等にピペット 0.5 mL を配る。メモ: プログラムし直された井戸からセル組み合わせて使用しない (すなわち、よく再プログラム 1 は最初 6 ウェル プレートに均等に分散する必要があります、2 番目の 6 ウェル プレートにプログラムし直されたよく 2 を均等に分散する必要があります)。 めっきされたセルを低-O2インキュベーターに戻します。行ったり来たり、左右にセルを均等に分散、各プレートを振る。旋回はしません。PSC 媒体を毎日交換してください。 8. ピッキング iPSC のコロニー 37 ° c. に PSC 媒体の事前暖かい 15 mL製造元の指示に従って hESC 修飾 ECM とシングル 6 ウェル プレートのすべての井戸をコートします。パラフィン フィルムでプレートを密封し、室温 1 時間それらを孵化させなさい Ips を収集するために使用されている井戸から培養液を吸い出しなさい。EDTA と吸引 1 mL で 1 回すすぎます。ウェルあたり EDTA の 1 mL を追加します。37 ° C で 4 分間インキュベートします。細胞の培養は、予め温めておいたプレートから ECM ソリューションを吸引、ウェルあたり PSC 培地 2 mL に置き換えます。プレート置いておきます。 インキュベーターから選択し、キャビネット、バイオ セーフティにおける配置に Ips とプレートを慎重に取り外します。注: この時点で、セル可能性があります非常に緩く付着と簡単に外れてしまい。 慎重に EDTA を吸い出しなさい。非常に穏やかに予め温めておいた PSC 媒体、iPSC のコロニーが外れないように世話の 3 mL を加えます。 プレートより反転または解離性範囲を視覚化する植民地に移動します。1 mL ピペット滅菌チップを準備します。優しくゆっくりと植民地を収集するために先端に液体を描きながら植民地をこすりするピペット チップを使用して完全に、プランジャーを押し下げます。IPSC コロニーを拾いながら可能な限り小さな媒体として描画します。 植民地を転送するには、ピペットの上下に 3-4 回ステップ 8.2 から ECM コーティング プレートの単一の井戸の。6 植民地を選んだおよび個々 の井戸に転送完了するまでを繰り返します。手順 7 で説明したオプション継が実行された場合、任意の単一の井戸から以上 2 コロニーを拾います。 すべての残りの井戸を凍結する標準的な人間の幹細胞のプロトコルを使用します。解凍し、再凍結する在庫をプレートより多くの植民地を後でピックアップする必要がある場合。 9. Ips の特性 TRA-1-60 染色リプログラミング効率 (18 日) の分析を実行します。注: 再プログラム 3 のうち 2 ウェルズは将来コロニーピッ キングの継代します。よく使用することができます残りのトラ-1-60 の汚損のため。研究室のベンチ上にこの手順を実行できます。 1 mL の PBS でよく、プログラムし直されたを洗い流します。5 分-20 ° C で氷冷メタノールで細胞を固定します。 メタノールを吸い出しなさい。乾燥約 2 分も過剰が乾燥しないよう注意してください。セル/マット半透明色になるとき十分な乾燥します。 穏やかな揺れでの 5 分の 1 mL の PBS とも 3 回洗います。洗浄中、3% 過酸化水素 in PBS の 3 mL を準備します。 PBS を吸い出しなさい。希釈過酸化水素溶液 2 mL を追加します。穏やかな揺れで室温で 15 分間インキュベートします。ブロッキング溶液 4 mL を準備: PBS で 10% ウシ血清アルブミン (BSA)。 過酸化水素溶液を吸引します。5 分の 1 mL の PBS とも 2 回を洗ってください。 PBS を吸引し、同様に解決を妨げる 2 mL を追加します。室温 1 時間インキュベートします。 穏やかな揺れでの 5 分の 1 mL の PBS とも 3 回洗います。 0.05% アジ化ナトリウムを添加したブロッキング液で 1: 100 で一次の対策-トラ-1-60 抗体を希釈します。6 ウェル フォーマット皿の 1 の抗体希釈の 1 mL を準備します。井戸の中に抗体希釈を追加し、パラフィルム蒸発を避けるためにプレートをラップします。穏やかな揺れで 4 ° C で一晩インキュベートします。注: 必要な場合、一次抗体の孵化は穏やかな揺れで常温 1 時間行うことが。一次抗体の希釈は、再 5 回まで使用できます。 一次抗体の孵化後、穏やかな揺れでの 5 分の 1 mL の PBS とも 3 回を洗ってください。 ブロッキング液で 1: 200 で二次抗マウス HRP 標識抗体を希釈します。穏やかな揺れで常温 2 時間二次抗体希釈で井戸を孵化させなさい。 二次抗体希釈を吸引し、穏やかな揺れで 5 分の 1 mL の PBS でよく 3 回洗浄します。 3 つ目の洗濯の際に製造元の指示に従って基板ソリューションを準備します。最終的な洗浄の後に、PBS を吸い出しなさい。基質溶液 1 mL を追加し、目的の色を開発する (約 10 分) までを孵化させなさい。 基板の解決を吸い出しなさい。軽く振りながら 5 分間水と井戸をすすいでください。 必要な場合は、コロニーをカウントします。リプログラミング効率 = (コロニー数)/(メッキ線維芽細胞数) x 100%。 長期保存のためステンド グラスのプレートからの水を吸引したシールで一晩乾燥板パラフィルムを風乾し、後でリプログラミング効率を評価するためには、2 年間の 4 ° C で保存します。