RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Werken onder omstandigheden RNase-vrij en gebruik van aseptische technieken indien mogelijk. Alle cel cultuur-gerelateerde bewerkingen uitvoeren in een biologische veiligheidskast met behulp van aseptische technieken. Volg institutionele bioveiligheid normen voor werk met menselijke cellen. 1. reagentia en apparatuur voor de bereiding van de initiatie herprogrammering Bereiden de bewerkt-mRNA cocktail coderen herprogrammering factoren. Volg de eerder gepubliceerde protocol10 te voeren in vitro transcriptie, aftopping, en procedures voor elke gewijzigde mRNA codering van individuele herprogrammering factor dephosphorylation. Na de definitieve zuivering, elueer de gemodificeerde mRNA met nuclease-gratis water, aanvulling van de gezuiverde gemodificeerde mRNA-oplossing met 1 U/µL RNase remmer kwantificeren van de gemodificeerde mRNAs met behulp van een spectrofotometer en opslaan bij-80 ° C voor maximaal 6 maanden. Bereiden meerdere aliquots van elke gewijzigde mRNA tot een minimum beperken van het aantal cycli bevriezen-ontdooien.Opmerking: Soortgelijke protocollen voor gemodificeerde mRNA productie geweest gemeld elders5,8,11. Sjablonen voor in vitro transcriptie kunnen worden gegenereerd door PCR versterking van overeenkomstige plasmide sjablonen gebruikend inleidingen die zijn vermeld in de Tabel van de materialen volgens de eerder gepubliceerde protocol10. Plasmide sjablonen voor elke herprogrammering factor (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) en mWasabi (control voor Transfectie) zijn verkrijgbaar bij Addgene, een non-profit plasmide repository. Meng alle gewijzigde mRNAs bij een molaire verhouding van 3:1:1:1:1:1 (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) en zijn inclusief 10% mWasabi bewerkt mRNA als een besturingselement voor de efficiëntie van de transfectie. Aanpassen van de concentratie van de volledige gemodificeerde mRNA herprogrammering mix om een eindconcentratie van 100 ng/µL door toevoeging van nuclease-gratis water aangevuld met 1 U/µL RNase-remmer. Bereiden van zeven 33 µL aliquots van de complete bewerkt mRNA cocktail. Opslaan van de gemengde herprogrammering aliquots bij-80 ° C.Opmerking: voor elke transfectie, 1.000 ng van de gemodificeerde mRNA cocktail per putje wordt toegevoegd (dat wil zeggen, een totaal van 3.000 ng voor 3 putten). Elke 33 µL aliquoot formaat van transfect 3 putjes van de plaat van een 6-well formaat wordt aangepast en bevat 3 µL van overtollige volume ter verantwoording voor pipetting fouten. Voorbereiding van zeven 33 µL aliquots volstaat om te voltooien een volledige fibroblast herprogrammering van 3 putten in een 6-well formaat plaat. De cocktail van miRNA nabootsers herprogrammering voor te bereiden. Los gelyofiliseerd miRNA nabootsers (Syn-heeft-miR-302a – 3p, Syn-heeft-miR-302b – 3p, Syn-heeft-miR – 302c – 3p, Syn-heeft-miR-302d-3 p, Syn-heeft-miR-367-3 p) tot een uiteindelijke concentratie van 5 pmol/µL (5 µM) in nuclease-gratis water aangevuld met 1 U/µL van RNase-remmer. Meerdere aliquots van elke miRNA mimic voor te bereiden en op te slaan bij-80 ° C voor lange termijn opslag. Meng alle miRNA nabootsers in een molaire 1:1:1:1:1 in verhouding tot een uiteindelijke concentratie van 5 pmol/µL (5 µM). Bereiden van zeven 14 µL aliquots van de miRNA bootst mix. Opslaan van de gemengde aliquots bij-80 ° C.Opmerking: Voor elke transfectie, 20 pmol van de miRNA nabootsers mix toegevoegd per putje (dat wil zeggen, een totaal van 60 pmol voor 3 putten). Elke 14 µL aliquoot formaat van transfect 3 putjes van de plaat van een 6-well formaat wordt aangepast en bevat 2 µL van overtollige volume ter verantwoording voor pipetting fouten. Voorbereiding van zeven 14 µL aliquots volstaat om te voltooien een volledige fibroblast herprogrammering van 3 putten in een 6-well formaat plaat. De buffer van de Transfectie te bereiden. Vooraf warm één flacon van 500 mL en een fles van 100 mL van verse verminderd-serum medium tot kamertemperatuur (RT) voor ongeveer 2 h. Gebruik geen een waterbad. Een pH-meter overbrengen in een kabinet bioveiligheid. Wassen van de meter glaselektrode met nuclease-gratis water. Kalibreren van de pH-meter volgens de vervaardiging’s instructies. De elektrode opnieuw met nuclease-gratis water wassen. Breng beide flessen van verminderd-serum medium in de kast bioveiligheid. Gebruik de flacon 500 mL RT om te passen van de pH. Wordt de basis pH van het verlaagd-serum medium door het invoegen van de pH-meter glaselektrode in de buffer. Wachten tot 1 min. vóór het lezen van de pH op de meter. 3-4 mL van de 1 M NaOH aan 500 mL van verminderd-serum medium toevoegen, sluit de fles en meng goed. Wachten tot 5 min. voor het openen van de fles voor pH-meting. De pH-meter-elektrode in de buffer invoegen en wacht totdat de lezing op de pH-meter stabiliseert. Doorgaan met het toevoegen van kleine hoeveelheden van 1 M NaOH totdat de pH verlaagd-serum medium 8.15 – 8.17 tot. Kalibreren van de pH-meter meerdere keren tijdens het proces. Als op enig moment de pH hoger dan 8.18 wordt, verminderen door toevoeging van vers verminderd-serum medium uit de voorverwarmde 100 mL fles (stap 1.3.1).Opmerking: De pH van de buffer verminderd-serum medium gebaseerde transfectie is van cruciaal belang. Herprogrammering zal lukken als de pH van de buffer van de transfectie ongeveer 8,2 ± 0,05 is, maar kan niet als de pH hoger dan 8,25 is. Daarom is het aangeraden om te stoppen met het toevoegen van NaOH zodra de pH van de buffer 8.15 – 8.17 bereikt. Dit zal ervoor zorgen dat de definitieve pH van de buffer van de transfectie ongeveer 8,2 – 8.22 na sterilisatie is. Filter steriliseren de transfectie buffer met behulp van een 0,22 µm vacuüm filtratie-systeem. Aliquot de gesteriliseerde buffer in 5 of 15 mL tubes met minimale luchtruim. Winkel aliquots van de transfectie buffer voor maximaal 3 maanden bij 4 ° C. Wordt de pH van de aliquots periodiek. Gooi de aliquots indien de pH hoger dan 8,25 is. Beperken aliquoot zede voor 2 transfections pas sinds Gasbedwelming met behulp van de transfectie buffer atmosferische lucht de pH van de buffer verhoogt. De fibroblast uitbreiding medium (FEM) bereiden: minimale essentiële medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1 x 1 x glutamine supplement, 55 µM 2-mercaptoethanol, niet-essentiële aminozuren, 1 x pen/strep/fungizone. Winkel de FEM bij 4 ° C. Bereiden het herprogrammering medium: DMEM/F12 (geen HEPES) aangevuld met 20% knockout serum vervanging (KOSR), 0,5 x niet-essentiële aminozuren, 0.5 x glutamine supplement, 55 µM 2-mercaptoethanol, 50 µg Mo/mL ascorbinezuur, 1 x pen/strep/fungizone, 100 ng/mL bFGF , en 200 ng/mL B18R. Bereiden van het medium bij de aanvang van de herprogrammering zonder bFGF en B18R, en op te slaan bij 4 ° C. Gebruik het niet verder dan 1 maand na voorbereiding. BFGF en B18R onmiddellijk vóór elk gebruik toevoegen aan een aliquot deel formaat voor die dag gebruik. Bereiden van het medium plating door toevoeging van 5% warmte-geïnactiveerd (HI) FBS in het herprogrammering medium met 20% KOSR zonder bFGF en B18R uit stap 1.5. De middellange fresh voor te bereiden op de dag van het beoogde gebruik. Voeg bFGF en B18R onmiddellijk vóór gebruik op dag 0 te herprogrammeren. Kalibreer de weefselkweek incubators voordat de herprogrammering volgens de instructies van de fabrikant met behulp van een handheld digitale CO2 analyzer. Gebruik een laag-O2 incubator voor de herprogrammering stappen om succesvolle iPSC generatie. 2. het kweken van fibroblasten voor herprogrammering Fibroblasten voorafgaand aan de inleiding van herprogrammering (dag -2) voor te bereiden. Jas een nieuwe 10 cm weefselkweek plaat met 5 mL 0,1% gelatine. Tik of swirl van de plaat om ervoor te zorgen dat het gehele oppervlak is bedekt. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Gecombineerd gelatine en voeg 10 mL van de FEM. Set opzij. Laat niet het gecoate oppervlak van de plaat te drogen alvorens toe te voegen FEM. Zorgvuldig gecombineerd het verbruikte medium van de fibroblasten. Spoel de cellen met 5 mL van de DPBS te verwijderen van de resterende serum. Voeg 3 mL trypsine-EDTA. Zachtjes rock de plaat om ervoor te zorgen volledige dekking over de gewenste cellen. Gecombineerd overtollige vocht, ~ 500 µL van trypsine verlaten. Doe niet teveel gecombineerd, aangezien dit kan drogen en doden van de fibroblasten. Incubeer de fibroblasten met trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C. Verwijderen de plaat uit de incubator en stevig maar voorzichtig Tik op de kant van de plaat te verjagen van de cellen. Controleer de cellen onder de Microscoop. Als de cellen vrijstaand en zwevende zijn, gaat u verder. Als de cellen nog steeds verbonden zijn, Incubeer gedurende een andere 3 minuten. Snel spoelen/verzamelen de vrijstaande cellen met behulp van 5 mL FEM te neutraliseren de trypsine-EDTA. Verplaats de fibroblast schorsing naar een conische tube van 15 mL. Controleer of de cellen goed gemengd. Meng voorzichtig de celsuspensie om te breken grote bosjes van cellen, dan rekenen ze op een hemocytometer. Overdracht 2.5 x 105 cellen in de gelatine beklede 10-cm schotel bereid in stap 2.1.1. Incubeer de cellen ‘s nachts in de 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde regelmatige weefselkweek incubator.Opmerking: De celdichtheid is cruciaal voor het bereiken van hoogrenderende herprogrammering, want het is belangrijk dat de fibroblasten gezond en snel verdelen zijn. Plating 2.5 x 105 cellen levert een 40-60% confluentie 2 dagen later voor de meeste fibroblast monsters. Het bedrag aanpassen voor zieke of verouderend cellen te bereiken van de gewenste 40-60% confluentie 48 uur later. Vervang het medium met 10 mL verse FEM de volgende dag (dag -1). Plaat van de fibroblasten om te starten (dag 0) te herprogrammeren. Controleer of de fibroblasten te herprogrammeren op 40-60% confluentie (Figuur 2, dag 0). Als de cellen over- of weinig heuvels zijn, passage van de fibroblasten, zoals beschreven in stap 2.1 en de dichtheid van de beplating dienovereenkomstig aan te passen. Cultuur voor nog eens 2 dagen. Breng 4 mL van DPBS in een conische tube van 15 mL. Voeg 100 µL van recombinante menselijke (rh) laminin-521. Pipetteer omhoog en omlaag om meng. Voeg 1 ml per putje van verdunde rhLaminin-521 in 3 putjes van de plaat van een 6-well. Incubeer de beklede plaat bij 37 ° C gedurende 2 uur. Warm 6 mL FEM en 4 mL plating middellange tot 37 ° C. Een aanvulling op het medium van de beplating met bFGF om een eindconcentratie van 100 ng/mL en B18R om een eindconcentratie van 200 ng/mL. Zorgvuldig gecombineerd het verbruikte medium van fibroblasten (stap 2.2.1). Spoel de cellen met 5 mL van DPBS en voeg 3 mL trypsine-EDTA. Zachtjes rock de plaat ter dekking van de cellen met trypsine-EDTA. Overtollige vocht, verlaten ~ 500 µL van trypsine, zoals gedaan in stap 2.1.3 gecombineerd. Incubeer de fibroblasten met trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C. Verwijderen de plaat uit de incubator en stevig maar voorzichtig Tik op de kant van de plaat te verjagen van de cellen. Controleer de cellen onder de Microscoop. Als de cellen vrijstaand en zwevende zijn, gaat u verder. Als de cellen nog steeds verbonden zijn, Incubeer gedurende een andere 3 minuten. Spoel-/ verzamelen de vrijstaande cellen met behulp van 5 mL FEM te neutraliseren de trypsine-EDTA. Verplaats de fibroblast schorsing naar een conische tube van 15 mL. Controleer of de cellen goed gemengd zijn en ze op een hemocytometer rekenen. Pipetteer 12.000 cellen in 4 mL voorverwarmde plating voedingsbodem uit stap 2.2.4.Opmerking: Niet centrifugeren van de cellen op elk gewenst moment. Het aantal vergulde cellen kan worden aangepast omhoog of omlaag als vereist voor langzaam of snel-groeiende lijnen, respectievelijk. Verwijder de beklede plaat uit de incubator en verdunde rhLaminin-521 de gecoate putjes gecombineerd. Laat niet het oppervlak van de putten te drogen. Zachtjes resuspendeer de cellen in het medium van de beplating. Pipetteer 1 mL celsuspensie in elk gecoat goed (dat wil zeggen, 3.000 cellen per putje). Plaats de vergulde cellen in een tri-gas weefselkweek incubator met O2 ingesteld op 5% (laag-O2). Zodra de plaat wordt neergezet, voorzichtig maar grondig dispergeren cellen door afwisselend een omhoog/omlaag en links/rechts beweging. Herhaal de bewegingen 2 meer tijden. Incubeer de cellen ‘s nachts. Wervelen niet de plaat te mengen. Pipetteer 4 mL herprogrammering middellange tot een conische tube van 15 mL en breng dit in de lage-O2 incubator met een losgedraaide GLB equilibreer ‘s nachts. Voeg geen bFGF en B18R tot de volgende dag. 3. Inleiding van herprogrammering (dag 1) Opmerking: Zodra de herprogrammering wordt geïnitieerd, dagelijks onderhoud is vereist voor ongeveer 1 maand. Zorg ervoor dat plan dienovereenkomstig. Alle latere cel incubations moeten worden uitgevoerd onder lage-O2 voorwaarden in de 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 bevochtigde tri-gas weefselkweek incubator. Vervang het plating medium ten minste 1 h vóór transfectie. Verwijder het equilibrated herprogrammering medium uit de lage-O2 incubator. BFGF toevoegen aan een eindconcentratie van 100 ng/mL en B18R om een eindconcentratie van 200 ng/mL. Meng goed. Doorgaan met 1 tegelijk goed, gebruik een pipet 1 mL aan het gebruikte medium verwijderen en te vervangen door 1 mL van herprogrammering medium aangevuld met bFGF en B18R. Herhaal dit voor elk putje. Gebruik geen vacuüm aspiratie, die overdreven droogt de cellen veroorzaakt stress en herprogrammering efficiëntie vermindert. Verplaats de plaat met cellen terug in de lage-O2 incubator. Transfect van fibroblasten met 5 µL van RNAiMax transfectiereagens per 1 µg gemodificeerde mRNA en 1 µL van het transfectiereagens per 6 pmol van miRNA bootst per transfectie.Opmerking: Optimale resultaten worden verkregen wanneer transfections gaan voor 16-20 h. De transfectiereagens is verdunde 10 x; de 100 ng/µL gemodificeerde mRNA cocktail is verdund 5 x; en de 5 pmol/µL miRNA nabootsers mix is verdund 8.33 x met de transfectie buffer vóór kleurverandering. Zie tabel 1 voor een overzicht van de transfectie setup. Terwijl de voorbereiding van de transfectie mixen, minimaliseren potentiële Gasbedwelming met behulp van reagentia RNase door standaard laboratoriumpraktijken te volgen. Equilibreer een aliquoot gedeelte van de transfectie buffer (stap 1.3) voor ongeveer 1 h op RT. Gebruik geen een waterbad 37 ° C of incubator de transfectie buffer opwarmen. Verwijder een enkele hoeveelheid gemodificeerde mRNAs (33 µL) en miRNA bootst (14 µL) van-80 ° C en warm ze aan RT voor ongeveer 3-5 min, totdat het ontdooid. Niet ontdooien de aliquots bij 37 ° C. Draai ze naar beneden kort in een microfuge. Warm de transfectiereagens aan RT voor ongeveer 3-5 min. Gebruik geen een waterbad 37 ° C of incubator. Omkeren van de gesloten buis 2 tot 3 keer te mengen van het reagens. Draai het naar beneden kort in een microfuge. Pipetteer 279 µL van de RT transfectie buffer in een microcentrifuge RNase-gratis buis. Voeg 31 µL van het transfectiereagens tot een eindvolume van 310 µL. Meng grondig door pipetteren. Doen niet vortex. Incubeer de buis op RT voor 1 min.Opmerking: Dit volume van de verdunde transfectiereagens volstaat tot complexe gemodificeerde mRNA zowel de miRNA bootst aliquots uit stap 3.2.3. 132 µL van de buffer van de transfectie RT aan het afgepipetteerde deel. 33 µL van gemodificeerde mRNA toevoegen. Voorzichtig te mengen Pipetteer: eindvolume is 165 µL. 102,6 µL van de buffer van de transfectie RT aan het monster 14 µL van miRNA nabootsers toevoegen. Voorzichtig te mengen Pipetteer: eindvolume is 116.6 µL. Voeg 165 µL van de verdunde transfectiereagens uit stap 3.2.5 tot de verdunde mRNA van stap 3.2.6 gewijzigd. Pipetteer te mengen: eindvolume is 330 µL. 116.6 µL van de verdunde transfectiereagens uit stap 3.2.5 toevoegen aan de verdunde miRNA nabootsers mix uit stap 3.2.7. Meng goed (eindvolume is 233.2 µL). Incubeer gedurende 15 minuten op RT dat de buffer van de Transfectie aan complex met de gewijzigde mRNAs en miRNA nabootst. Verwijder de plaat met cellen uit de lage-O2 incubator. Voeg 100 µL (1 µg) van de complexvorm bewerkt mRNA transfectie mix aan elk putje, ontkleuring in de put. Het verspreiden van de complexen van de transfectie door voorzichtig maar grondig het schudden van de plaat met een omhoog/omlaag en links/rechts beweging. Wervelen niet de plaat te mengen. Voeg 66,7 µL (20 pmol) van de complexvorm miRNA nabootsers transfectie mix aan elk putje, ontkleuring in de put. Dispergeren complexen van de transfectie door voorzichtig maar grondig het schudden van de plaat met een omhoog/omlaag en links/rechts beweging. Wervelen niet de plaat te mengen. Plaats de transfected cellen in de incubator tri-gas met O2 ingesteld op 5% (laag-O2). Zodra de plaat wordt neergezet, verspreiden de transfectie complexen opnieuw door voorzichtig maar grondig het schudden van de plaat met een omhoog/omlaag en links/rechts beweging. Pipetteer 4 mL medium in een conische tube van 15 mL te herprogrammeren en plaats deze in de laag-O2 incubator met losgedraaide GLB equilibreer ‘s nachts. Voeg geen bFGF en B18R tot de volgende dag. Buis 1 – RNAiMax-verdunning (1ste mix) Reagens Concentratie Volume Buffer van de Transfectie 279 ΜL RNAiMax (2e toevoegen) 10 x 31 ΜL Totaal: 310 µL (Incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur) Buis 2 – gemodificeerde mRNA mix (2e mix) Reagens Concentratie Volume gemodificeerde mRNA mix 100 ng/µL (5 x) 33 ΜL Buffer van de Transfectie 132 ΜL Totaal: 165 µL (het toevoegen van gelijk volume verdunde RNAiMax van buis-1) Buis 3 – miRNA nabootsers mix (3e mix) Reagens Concentratie Volume miRNA bootst mix 5 pmol/µL (8.33 x) 14 ΜL Buffer van de Transfectie 102,6 ΜL Totaal: 116.6 µL (het toevoegen van gelijk volume verdunde RNAiMax van buis-1) Tabel 1: Voorbereiding voor Transfectie mix. 4. ter vervanging van herprogrammering Medium tussen Transfections (dagen 2, 4, 6, 8, 10 en 12) Vervang de middellange 16-20 h na transfectie zoals beschreven in 3.1.1–3.1.2. BFGF toevoegen aan een eindconcentratie van 100 ng/mL en B18R om een eindconcentratie van 200 ng/mL in herprogrammering middellange aliquots. Monitor mWasabi expressie dagelijks te bevestigen van transfectie kwaliteit met behulp van een microscoop die is geconfigureerd voor het visualiseren van EGFP.Opmerking: mWasabi expressie moet minimaal blijken op dag 2 en toename van helderheid met elke extra transfectie. 5. elk-ander-dag Transfections (dagen 3, 5, 7, 9, 11 en 13) Voert de transfectie zoals beschreven in stap 3.2. Wijzig het medium niet op dagen van transfectie. Bereiden van een hoeveelheid van 4 mL medium te herprogrammeren en plaats deze in de laag-O2 incubator aan equilibreer gedurende de middellange verandering op de volgende dag. Voeg geen bFGF en B18R tot de volgende dag. 6. de procedures moeten worden uitgevoerd na definitieve transfectie Dagelijkse middellange wijzigingen uitvoeren vanaf dag 14 door ongeveer dag 17. Warm 7 mL herprogrammering middellange tot 37 ° C. BFGF toevoegen aan een eindconcentratie van 100 ng/mL.Opmerking: B18R is niet langer nodig na de definitieve transfectie. Buiten dag 14 is het niet langer nodig om het medium’s nachts in de laag-O2 incubator equilibreer. Verwijder het medium van alle putjes met behulp van een precisiepipet serologische. Vermijd het gebruik van ambitie blijven. Voeg toe 2 mL medium aangevuld met bFGF per putje te herprogrammeren. Op dag 17 en 18, analyseren de geherprogrammeerde putten onder een Microscoop omgekeerde of ontleden. Als kolonies worden gevormd in de nabijheid van elkaar dankzij hoog rendement te herprogrammeren en niet kunnen handmatig geïsoleerd worden, scheidt u de kolonies door het uitvoeren van een optionele passaging van geherprogrammeerde putten die zijn beschreven in stap 7 hieronder. Als kolonies schaars en goed gescheiden zijn, handmatig kiezen de klonen rechtstreeks vanuit de geherprogrammeerde goed zoals beschreven in stap 8 en subcultuur iPSCs volgens standaard protocollen. 7. facultatieve Procedure: Passaging cellen geherprogrammeerd putjes met behulp van EDTA 0,5 mM EDTA in DPBS (EDTA) bereid door verdunning van de stockoplossing van de EDTA 0.5 M. Filter steriliseren EDTA met behulp van een 0,22 µm vacuüm filtratie-systeem. Feeder-vrije pluripotente stamcel (PSC) medium (bijvoorbeeld mTeSR1) volgens instructies van de fabrikant voor te bereiden. Vooraf warm 32 milliliters PSC middellange tot 37 ° C. Jas alle putjes van twee 6-well formaat platen met hESC-gekwalificeerde extracellulaire matrix (ECM) volgens de instructies van de fabrikant. Zegel platen met parafin film en hen Incubeer gedurende 1 h op RT. De ECM-oplossing aan de voorverwarmde platen gecombineerd en 2 mL van PSC medium per putje te vervangen. Laat niet het oppervlak van de putten te drogen. Ze gereserveerd. Het herprogrammering medium uit 2 geherprogrammeerde putten gecombineerd op een dag wanneer de koloniën groot en duidelijk gevormde zijn (meestal dag 18). Spoel één keer met 1 mL EDTA en aspirate. Voeg 1 mL EDTA per putje. Incubeer gedurende 4 minuten bij 37 ° C. Zachtjes verwijderen de plaat uit de incubator en plaats deze in de bioveiligheid kabinet.Opmerking: op dit punt, cellen mogelijk zeer losjes zelfklevend en gemakkelijk verdreven. Zorgvuldig gecombineerd EDTA uit beide putten. Voeg 3 mL van voorverwarmde PSC medium aan elk goed behandeld met EDTA. Gebruik een cel-schraper te voorzichtig maar grondig verjagen cellen uit beide putten. Gebruik een serologische pipet zachtjes de celsuspensie Pipetteer en breken grote bosjes. Niet Pipetteer totdat alle de cel klontjes verdwenen zijn. Behoud van iPSC clusters.Opmerking: Grote bosjes Plating zal geen invloed op iPSC kolonie uitgroei. Als er buitensporig grote cel klontjes, gewoon vermijden hen overbrengen naar de volgende schotel. Met behulp van een serologische precisiepipet, verdeel cellen uit elk putje EDTA-behandeld door pipetting 0,5 mL in elk putje van de 6-well ECM beklede plaat.Opmerking: Cellen uit de geherprogrammeerde putten niet combineren (dat wil zeggen, goed geherprogrammeerd 1 dient gelijkmatig te worden verdeeld in de eerste 6-well-plaat en geherprogrammeerde goed 2 gelijkmatig verdeeld moeten worden in de tweede 6-well-plaat). Verplaats de vergulde cellen terug in de lage-O2 incubator. Schud om gelijkmatig verdelen cellen, elke plaat heen-en-weer en links-naar-rechts. Niet wervelen. Vervang dagelijks het PSC-medium. 8. picking iPSC kolonies Vooraf warm 15 mL PSC middellange tot 37 ° C. Jas alle putjes van een enkele 6-well plaat met hESC-gekwalificeerde ECM na instructies van de fabrikant. Zegel van de platen met paraffine film en hen Incubeer gedurende 1 h op RT. Gecombineerd het kweekmedium uit putten wordt gebruikt voor het verzamelen van iPSCs. Spoel één keer met 1 mL EDTA en aspirate. Voeg 1 mL EDTA per putje. Incubeer gedurende 4 minuten bij 37° C. Terwijl de cellen worden aan het broeden, gecombineerd de ECM-oplossing uit de voorverwarmde borden en vervangen van 2 mL van PSC medium per putje. De platen worden gereserveerd. Verwijder voorzichtig de plaat met iPSCs moeten worden gepickt uit de incubator en plaatst u deze in het biosafety kabinet.Opmerking: op dit punt, cellen mogelijk zeer losjes zelfklevend en gemakkelijk verdreven. Zorgvuldig gecombineerd EDTA. Heel zachtjes Voeg 3 mL van voorverwarmde PSC medium, verzorgen niet te verjagen iPSC kolonies. Verplaats de plaat naar een bereik van het inverted of ontleden beter visualiseren kolonies. Een pipet 1 mL met een steriele tip voor te bereiden. Druk de plunjer volledig en gebruik vervolgens het uiteinde van de pipet zachtjes schrapen een kolonie terwijl u de vloeistof langzaam in de tip om het verzamelen van de kolonie. Tekenen als kleine medium mogelijk terwijl het oppakken van de iPSC-kolonie. Als u wilt overbrengen van de kolonie, Pipetteer omhoog en omlaag 3-4 keer in een enkel putje van de ECM beklede plaat uit stap 8.2. Herhaal totdat 6 kolonies zijn geplukt en overgedragen naar afzonderlijke wells. Kies niet meer dan 2 kolonies uit een enkele bron als een optionele passaging beschreven in stap 7 is verricht. Gebruik een standaard menselijke stamcellen protocol te bevriezen van alle resterende putjes. Ontdooien, en bevroren voorraden opnieuw plaat als meer koloniën later moeten worden gepickt. 9. karakterisatie van iPSCs TRA-1-60 kleuring voor analyse van herprogrammering van efficiëntie (dag 18) uitvoerenOpmerking: 2 van de 3 geherprogrammeerd putten zijn gepasseerd voor toekomstige kolonie picken. De resterende goed kan worden gebruikt voor de kleuring van de TRA-1-60. Deze procedure kan worden uitgevoerd op de top van de Bank laboratorium. Was de geherprogrammeerde goed met 1 mL PBS. Het herstellen van cellen met ijskoude methanol bij-20 ° C gedurende 5 minuten. Gecombineerd methanol. Droog de put voor ongeveer 2 min. Wees voorzichtig niet te veel te droog. De cellen hebben gedroogd genoeg wanneer ze een doorschijnend/matte kleur. Was het nou 3 keer met 1 mL PBS voor 5 min met zacht schudden. Tijdens de wast, bereiden 3 mL 3% waterstofperoxide in PBS. De PBS gecombineerd. Voeg toe 2 mL verdunde peroxide oplossing. Incubeer gedurende 15 min op RT met zacht schudden. Bereiden van 4 mL van de blokkerende oplossing: 10% runderen-serum albumine (BSA) in PBS. De peroxide oplossing gecombineerd. Het goed 2 keer met 1 mL PBS gedurende 5 minuten wassen. PBS gecombineerd en voeg 2 mL van het blokkeren van de oplossing in de put. Incubeer gedurende 1 h op RT. Was het nou 3 keer met 1 mL PBS voor 5 min met zacht schudden. Verdun primair anti-TRA-1-60 antilichaam op 1:100 in de blokkerende oplossing aangevuld met 0,05% natriumazide. Bereiden 1 mL verdunning van het antilichaam voor 1 goed van een 6-well formaat schotel. De antilichaam-verdunning toevoegen naar de waterput en wikkel de plaat met parafilm om verdamping. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C met zacht schudden.Opmerking: Indien nodig, de incubatie met het primaire antilichaam kan gebeuren voor 1 h bij RT met zacht schudden. De verdunning van het primaire antilichaam kan opnieuw gebruikt worden tot 5 keer. Na incubatie met het primaire antilichaam, wassen het goed 3 keer met 1 mL PBS voor 5 min met zacht schudden. Verdun het secundaire anti-muis HRP-geconjugeerde antilichaam op 1:200 in de blokkerende oplossing. Incubeer de put met de verdunning van het secundair antilichaam voor 2 h op RT met zacht schudden. De verdunning secundair antilichaam gecombineerd en wassen van de goed 3 keer met 1 mL PBS voor 5 min met zacht schudden. Tijdens de derde wash, bereiden de substraat oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Na de definitieve wash, gecombineerd PBS. Voeg 1 mL van de oplossing van het substraat en incubeer tot gewenste kleur ontwikkelt (ongeveer 10 min). Het substraat oplossing gecombineerd. Spoel de put met water gedurende 5 minuten terwijl het zachtjes te schudden. Tellen de koloniën, indien gewenst. Herprogrammering efficiëntie = (aantal kolonies) / (aantal vergulde fibroblasten) x 100%. Voor langdurige opslag, water uit de gekleurde plaat gecombineerd en ‘s nachts drogen op RT. Seal de gedroogde plaat met parafilm bewaren bij 4 ° C voor maximaal 2 jaar herprogrammering om efficiëntie te beoordelen later.