الجيش الملكي النيبالي على إعادة برمجة الليفية الأولية البشرية داخل الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent
Summary
هنا يمكننا وصف أسلوب ذات الصلة سريرياً، ذات الكفاءة العالية، وخالية من علبة التغذية بالورق لإعادة برمجة الخلايا الليفية الأولية البشرية في الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent استخدام مرناس تعديل الترميز عوامل إعادة برمجة ويحاكي ناضجة microRNA-367/302. يتم أيضا تضمين أساليب لتقييم الكفاءة، وإعادة برمجة توسيع المستعمرات الاستنساخ اللجنة التوجيهية، وتأكيد التعبير عن علامة بلوريبوتينسي هيئة تنظيم الاتصالات-1-60.
Abstract
وأثبتت الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) لتكون أداة قيمة لدراسة التنمية البشرية والمرض. يتطلب مواصلة النهوض إيبسكس التجدد العلاجية آمنة، قوية، وبروتوكول إعادة برمجة المناسب. نقدم هنا، بروتوكول ذات الصلة سريرياً، خطوة بخطوة للغاية ذات الكفاءة العالية إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد البشري في إيبسكس باستخدام نهج غير دمج. يتكون جوهر البروتوكول للتعبير عن العوامل بلوريبوتينسي (SOX2، KLF4، كميك، LIN28A، نانوج، OCT4-دخولها الانصهار) من في المختبر الكشف رسول يدون توليفها مع تعديل النيوكليوتيدات (مرناس المعدلة). هي transfected مرناس تعديل إعادة برمجة في الخلايا الليفية الأولية كل 48 ساعة إلى جانب ناضجة يقلد microRNA-367/302 الخاصة بالخلايا الجذعية الجنينية لمدة أسبوعين. المستعمرات اللجنة التوجيهية الناتجة يمكن ثم عزل وتوسيع مباشرة في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق. لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة والاتساق لدينا بروتوكول إعادة برمجة عبر عينات تنتجها الخلايا الليفية، ونحن قد الأمثل المعلمات المختلفة بما في ذلك نظام تعداء الجيش الملكي النيبالي، توقيت ترانسفيكتيونس وشروط الثقافة وكثافة البذر. الأهم من ذلك، يولد لدينا أسلوب إيبسكس عالية الجودة من معظم المصادر تنتجها الخلايا الليفية، بما في ذلك عينات لإعادة برمجة المريضة، الذين تتراوح أعمارهم بين، و/أو مسن.
Introduction
إعادة برمجة خلايا جسدية في الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) يتطلب التعبير الموسعة لمجموعة أساسية من عوامل النسخ التي تعتبر مهمة في الحفاظ على بلوريبوتينسي1،2. عند إنتاج إيبسكس للتطبيقات السريرية، من الضروري أن يتم تصغير عبء حيث في خلايا الإدخال أثناء معالجة وهو الحفاظ على كفاءة توليد اللجنة التوجيهية على مستوى عال نسبيا عبر عينات المرضى. إلا أن الغالبية من إعادة برمجة أساليب، بما في ذلك البروتوكولات خالية من التكامل، تعاني من كفاءات إعادة برمجة منخفضة جداً، أي فائدة السريرية الحد من هذه النهج3. انخفاض كفاءة إعادة برمجة قد تعزز أيضا انتقائية إعادة برمجة الخلايا تحمل الطفرات الموجودة مسبقاً، زيادة العبء حيث في إيبسكس الناجمة عن ذلك. وبالإضافة إلى ذلك، كافة على أساس الحمض النووي إعادة برمجة أساليب، مثل لينتيفيروس وابيسومال–النهج المستندة إلى، يعانون من القلق إزاء سلامة أن الحمض النووي قد عشوائياً دمج الجينوم ويهيئ الفرصة للطفرات insertional الضارة وغير المرغوب فيها ( يحتمل أن تكون النمطان) التعبير عن الجينات بلوريبوتينسي في الأنسجة المصب مشتقات4.
اتباع نهج واعدة لتحقيق كفاءة تنظيم دورات تعريفية بلوريبوتينسي في خلايا جسدية والحد من عبء حيث في إيبسكس الناجمة عن ذلك استخدام الكشف رسول توج الاصطناعية التي تتضمن تعديل نوكليوباسيس (مرناس المعدلة) لإعادة برمجة5. يمكن زيادة تعزيز كفاءة تعديل نهج إعادة برمجة تستند إلى مرناً بإضافة الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)-microRNAs محددة (ميرناس)-367/302s3، التي أظهرت لإعادة برمجة خلايا جسدية مع زيادة كفاءة6 ،7. بيد حتى مع إضافة ميرناس-367/302s، كثيرا ما معدلة مرناً النهج القائم في إعادة برمجة يفشل أثناء التطبيق إلى خلايا المريض معزولة طازجة3. لمعالجة التناقضات لهذا النهج المعدل على أساس مرناً، ونحن قد أبلغت مؤخرا استراتيجية محسنة، وخالية من التكامل الذي يدفع بلوريبوتينسي في الخلايا الليفية الأولية البشرية مع نسبة نجاح عالية، ويستخدم كلا مرناس تعديل الترميز إعادة برمجة العوامل وناضجة ميرنا-367/302 يحاكي8. في أسلوبنا، يتضمن إعادة برمجة مرناً معدلة كوكتيل نسخة معدلة من OCT4 تنصهر مع دخولها المجال (تسمى س م3) ترانساكتيفيشن9 وخمسة عوامل إعادة برمجة أخرى (SOX2، KLF4، كميك، LIN28A، ونانوج). الجمع بين مرناً تعديل الترميز العوامل بلوريبوتينسي مع ميرنا يقلد يبدو أثر تآزري على إعادة برمجة الكفاءات في هذا البروتوكول. تحسينات إضافية لنظام تعداء الجيش الملكي النيبالي، خلية البذر، وتثقيف شروط ضرورية أيضا لزيادة كفاءة إعادة برمجة النهج إلى مستوى فائقة8.
وخلافا للعديد من البروتوكولات الأخرى، يتطلب نهجنا إعادة برمجة عادة سوى بضعة آلاف الإدخال الليفية. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من غير دمج استراتيجيات مشتركة باستخدام البلازميدات ابيسومال، الفيروس سينداي، أو الحمض النووي الريبي ذاتية تنطوي على باساجينج واسعة النطاق تمييع ناقل إعادة برمجة في إيبسكس الذي تم إنشاؤه. على العكس من ذلك، تعديل مرناً ويقلد ميرنا ناضجة لها نصف عمر قصيرة ويتم التخلص سريعاً من الخلايا. أخذت معا، مقدار الوقت ثقافة الخلية التراكمي بين جمع عينات المرضى وتوليد إيبسكس للاستخدام الحد الأدنى في هذا النهج، ويحد من فعالية تراكم الطفرات في إيبسكس الناجمة عن ذلك وتحسين الفعالية من حيث التكلفة.
وهنا، يقدم البروتوكول مفصلة خطوة بخطوة لتحقيق الكفاءة العالية إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية الكبار إلى إيبسكس استخدام النهج المعدل اندماجي مرناً/ميرنا القائم لدينا8. يوفر هذا البروتوكول إعادة برمجة تستند إلى الجيش الملكي النيبالي طريقة واضحة وفعالة من حيث التكلفة، وقوية لتوليد إيبسكس خالية من التكامل للبحوث وإمكانات التطبيقات السريرية. وعلاوة على ذلك، أنها تنطبق على إعادة برمجة مجموعة متنوعة من خطوط تنتجها الخلايا الليفية بما في ذلك صعوبة–إلى–إعادة برمجة، المرتبطة بالمرض، الليفية أعمارهم، ومسن. ويرد في الشكل 1تخطيطي للبروتوكول المتعلق بإعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية. ويصف البروتوكول على وجه التحديد طريقة لإعادة برمجة ثلاث آبار للبشرية الليفية الأولية الكبار في لوحة شكل 6-جيدا. بئرين العائد عادة عددا كافياً من المستعمرات اللجنة التوجيهية عالية الجودة. في كثير من الحالات، واحد فقط أيضا ضروري، والثالث أيضا يمكن أن تستخدم لتحليل إعادة برمجة الكفاءة. إذا لزم الأمر، يمكن زيادتها العدد الآبار.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول وصف أسلوب ذات الصلة سريرياً، وعدم إدماج، المستندة إلى الجيش الملكي النيبالي الذي يسمح بإعادة برمجة خطوط تنتجها الخلايا الليفية البشرية العادية والمرتبطة بالمرض في إيبسكس في كفاءة فائقة. وحتى الآن، أثمر كل سطر البشرية تنتجها الخلايا الليفية حاولنا إعادة برمجة مع بروتوكول وصف عددا مرضيا من إيبسكس عالية الجودة لتطبيقات المتلقين للمعلومات. يمكن فورا نقل إيبسكس الناجمة عن ذلك وتوسعت في ظروف خالية من تغذية الثقافة.
نوعية الخلايا الليفية لإعادة البرمجة:
إعادة برمجة النجاح يعتمد اعتماداً كبيرا على نوعية ابتداء من الخلايا الليفية. ومن الناحية المثالية، ينبغي بدء إعادة برمجة مع أدنى الليفية مرور المتاحة لتحقيق كفاءة أعلى. من الأفضل إعادة برمجة الكفاءة مع الخلايا الليفية لمرور 2 – 4. إعادة برمجة يمكن أن لا تزال تعمل مع عالية-المرور (مرور 5 – 8)، الليفية حتى مسن، أن كان ذلك مع انخفاض الكفاءة. في بعض الأحيان الليفية مرور منخفضة غير متوفرة أو عينات المرضى طفرة جينية تمنع نمو صحي. وفي هذه الحالة، قد يلزم الاستفادة المثلى كثافة الطلاء الأولى. إعادة برمجة خطوط الخطر تنتجها الخلايا الليفية يرتبط عادة بموت الخلية زيادة خلال ترانسفيكشنز الحمض النووي الريبي. كنتيجة لذلك، سوف تظهر الخلايا في إعادة برمجة جيدا يكون متفرق بأيام 10-14 إعادة برمجة. المناطق اللاخلوي الكبيرة ستكون أيضا مرئية في البئر. إذا كان هذا هو الحال، سوف تحتاج بروتوكول إعادة برمجة لتكون إعادة بدأت مع ارتفاع عدد انطلاق أولية الليفية. تصفيح خلايا الإدخال 3,000 كل من طبق الشكل 6-جيدا جيدا يعمل باستمرار لمعظم البالغين تنتجها الخلايا الليفية خطوط. ومع ذلك، زيادة عدد الطلاء إلى 5,000 – 10000 (50,000 لخطوط مسن) قد تساعد على تحسين إعادة برمجة للعينات المرتبطة بالمرض، كما أفيد في أعمالنا المنشور السابق8. على العكس من ذلك، كما يمكن مقاومة لإعادة برمجة الخلايا التوصل إلى كونفلوينسي في وقت مبكر جداً. إذا كانت الخلايا التي تمر ترانسفيكشنز مع إعادة برمجة الكشف تنتشر سريعاً جداً (كما الحال بالنسبة للابتدائي الليفية الولدان أحياناً)، والشروع في إعادة برمجة مع الليفية 500 كل بئر طبق الشكل 6-بئر8.
التعامل مع تعداء المخزن المؤقت:
الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت تعداء (المصل خفض متوسط تعديلها لدرجة حموضة 8.2) أمر بالغ الأهمية لتحقيق الكفاءة المثلى تعداء المطلوبة لهذا إعادة برمجة البروتوكول. لهذا السبب، ينصح احتياطات عديدة فيما يتعلق بالتعامل مع المخزن المؤقت تعداء. وقد وجدنا أن التعرض القصير حتى المخزن المؤقت تعداء إلى الهواء الجوي يؤثر على درجة الحموضة من المخزن المؤقت. ولذلك، ينبغي أن يكون المخزن المؤقت تعداء اليكووتيد في وعاء ملولبة مع الحد الأدنى من الفضاء الجوي (ونحن نستخدم 5 أو 15 مل مخروطية أنابيب ملولبة). كذلك تقليل التعرض للهواء، استخدام كل تعداء المخزن المؤقت الكوة لمدة أقصاها سنتين ترانسفيكشنز. وأخيراً، منذ الحموضة آثار درجة الحرارة، من الأهمية بمكان أن المخزن المؤقت تعداء هو اكويليبراتيد إلى RT لجمعية المجمعات تعداء. وينصح الحارة لا تعداء المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية.
باساجينج من إيبسكس:
بينما كثير نشر قبل التوصية بروتوكولات الانتقاء المستعمرات اللجنة التوجيهية الفردية في نهاية إعادة برمجة، هذا قد يكون من الصعب تحقيق عند كفاءة إعادة برمجة مرتفع جداً أو إذا كانت المستعمرات العنقودية معا، كما الحال في كثير من الأحيان لدينا البروتوكول. ولذلك، إذا كانت مستعمرات اللجنة التوجيهية على مقربة من بعضها البعض، نوصي أولاً باساجينج الخلايا انتشرت إيبسكس أعيدت برمجتها قبل الانتقاء يدوياً المستعمرات. وهناك العديد من المزايا لإجراء هذه الخطوة المرور المبكر. يتباعد المستعمرات يمنحهم مجالاً أكبر النمو، تدر أكبر بكثير من المستعمرات للانتقاء مما يمكن تحقيقه إلا في البئر الأصلي. وهذا يحسن إلى حد كبير معدل النجاح في إنشاء خط اللجنة التوجيهية من استنساخ المنتقاة. ونجد أيضا أن يظهر الوقت ثقافة إضافية مع الخلايا الليفية، أن كان ذلك بنسبة مخففة، لتحسين جودة متوسط المستعمرات المنتقاة في اللجنة التوجيهية. قد توفر الليفية غير كامل أعيدت برمجتها عوامل paracrine الدعم، التي تواصل المساعدة في إنشاء إيبسكس وتسهيل الانتقال مباشرة إلى الخلية خالية من تغذية ثقافة الظروف. وقد الليفية مصادفة عيب نمو انتقائي مقارنة إيبسكس عند مثقف في mTeSR1. ولذلك، هو بسرعة تضعف السكان خلية تنتجها الخلايا الليفية تلويث لكميات ضئيلة داخل الممرات 3 – 4.
مثبطات روك مثل Y-27632 تستخدم بشكل متكرر للثقافة الروتينية من إيبسكس البشرية. وقد وجدنا أن الثقافة متكررة و/أو الموسعة لبعض الخطوط التوجيهية مع Y-27632 يمكن أن يكون آثار ضارة على الجودة الشاملة. عند استخدام أجمة باساجينج الأسلوب، كما هو الحال مع يدتا، Y-27632 ليس من الضروري للحفاظ على صلاحية اللجنة التوجيهية بعد تقسيم. وقد تخلصنا تماما الوسائط المكملة مع Y-27632 لجميع عزل اللجنة التوجيهية أو التوسع أو الثقافة الروتينية.
قيود البروتوكول:
وهو القيد واحد لوصف الجيش الملكي النيبالي النهج القائم في إعادة برمجة التكلفة الأولية والتعقيد المرتبطة بإعداد الكواشف إعادة برمجة. على الرغم من أن الإجراءات التحضيرية لتوليد مرناً الكواشف الروتينية كافة وقد سبق وصف (PCR، النسخ في المختبر ، العلاج الدناز، وضع سقف، ديفوسفوريليشن، وتنقية)، تراكمياً إنتاج الكواشف مرناً عملية طويلة نسبيا وغير تافهة. التحدي الرئيسية الأخرى لهذا البروتوكول هو الحاجة إلى ترانسفيكت كل 48 ساعة، زيادة كثافة العمالة من بروتوكول إعادة برمجة الخلايا. هذه الاعتبارات قد تكون باهظة إذا هي رغبت في إعادة برمجة فقط بضع عينات المرضى. ومع ذلك، إذا كان الاعتبار الأساسي هو الجيل من إيبسكس ذات الصلة سريرياً أو تحقيق كفاءة إعادة برمجة عالية جداً، وصف الجيش الملكي النيبالي النهج القائم في إعادة برمجة مثالي.
وباختصار، الموصوفة عالية الكفاءة على أساس الحمض النووي الريبي إعادة برمجة الأسلوب يتوقف على كفاءة تعداء الأمثل لنوع الخلية الجسمية إعادة برمجتها كما هو موضح في أعمالنا المنشور السابق8. البروتوكول تعداء الحمض النووي الريبي المعروضة في هذه الدراسة جداً ضبطها للخلايا الليفية الأولية البشرية لكن محتملة يمكن أن تكون مصممة لأنواع الخلايا الأخرى لتحسين كفاءة إعادة برمجة خلايا جسدية مختلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للدعم التمويلي من المعاهد الوطنية للصحة (T32AR007411-33) وفي جامعة كولورادو الجلد الأمراض الأساسية مركز أبحاث (P30AR057212). ونشكر أيضا “الشراكة البحثية انحلال البشرة الفقاعي” (EB)، EB مؤسسة البحوث الطبية، و “علاج EB الخيرية”، تندب انحلال البشرة الفقاعي البحوث رابطة (ديبرا) الدولية ومؤسسة الملك بودوان صندوق فلينديركيندجي، والبوابات حدود الصندوق.
Materials
| Plasmid templates for PCR | |||
| pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
| pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
| pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
| pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
| pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
| pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
| pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
| Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
| Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
| (ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
| Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
| Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
| Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
| RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
| Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
| Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
| Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
| Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
| Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
| Fibroblast culture and reprogramming | |||
| 0.1% Gelatin in H2O | stemcell technologies | #07903 | |
| Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| 6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
| FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
| GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
| Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
| MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
| Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
| Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
| iPSC culture | |||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
| EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
| Antibodies and Detection | |||
| Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
| Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
| Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
| Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
| VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| Special Equipment | |||
| Description | Notes | ||
| Biological safety cabinet | |||
| Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37°C. | ||
| Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37°C. Use for the reprogramming procedure. | ||
| pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
| Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. | ||
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science. 302 (5644), 415-419 (2003).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
- Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943 (2014).
