Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия
Summary
Здесь представлены два метода, которые могут использоваться отдельно или в сочетании для анализа воздействия бета амилоида на структуру сгусток фибрина. Включено — это протокол для создания фибрина в vitro сгусток, следуют сгусток мутность и растровая электронная микроскопия методы.
Abstract
Эта статья представляет методы для генерации в сгустков фибрина in vitro и анализируя эффект бета амилоида (значения) белка на сгустков и структура спектрометрическим методом и растровая электронная микроскопия (SEM). Было показано, что значения, который образует нейротоксическое амилоидных агрегатов в болезни Альцгеймера (AD), взаимодействовать с фибриногена. Это значения фибриноген взаимодействие делает сгусток фибрина структурно ненормальное и устойчивы к фибринолиза. Значения индуцированной аномалии в фибрин свертывания может также способствовать цереброваскулярные аспекты AD патологии как квадрантной, воспаления, а так же, Церебральный амилоидные ангиопатии (УГА). Учитывая потенциально решающую роль нервно-сосудистого дефицита в AD патологии, разработке соединений, которые могут препятствовать или уменьшить значения фибриноген взаимодействия имеет многообещающие терапевтическую ценность. В vitro методы, которые фибрина сгустков можно легко и систематически оценивать являются потенциально полезными инструментами для разработки терапевтических соединений. Представленные здесь является оптимизированный протокол в vitro поколения фибринового сгустка, а также анализ влияния значения и значения фибриноген взаимодействие ингибиторов. Сгусток мутность быстрое, высокую воспроизводимость и может использоваться для проверки нескольких условий одновременно, позволяя для скрининга большого числа ингибиторов фибриноген значения. Хит соединений из этой проверки может оцениваться дальнейшие за их способность улучшить значения индуцированные структурные аномалии фибринового сгустка архитектуры с использованием SEM. Эффективность этих оптимизированных протоколов свидетельствует здесь с помощью TDI-2760, ингибитор взаимодействия недавно выявленных значения фибриногена.
Introduction
Болезнь Альцгеймера (AD), нейродегенеративных заболеваний, ведущих к когнитивным снижением пожилых пациентов, преимущественно возникает из ненормальное бета амилоида (значения) выражение, агрегирование и нарушением Распродажа результате нейротоксичность1, 2. Несмотря на хорошо изученных связь между значения агрегатов и объявление3, точные механизмы, лежащие в основе заболевания патология не являются хорошо понимали4. Все больше фактов предполагает нервно-сосудистого дефицита играть роль в прогрессии и тяжести AD5, как значения непосредственно взаимодействует с компонентами системы кровообращения6. Значения есть высокоспецифичных взаимодействие с фибриноген7,8, который также локализует значения вкладов в AD пациентов и мыши модели9,10,11. Кроме того значения фибриноген взаимодействия вызывает аномальные фибрин-сгустков и структура, а также сопротивление фибринолиза9,12. Один терапевтические возможности в лечении AD, облегчение кровообращения дефицита путем ингибирования взаимодействие между Aβ и фибриногена13,14. Мы, таким образом, определены несколько небольших соединений, ингибирующих значения фибриноген взаимодействия с помощью скрининга высокую пропускную способность и фармацевтическая химия подходы13,14. Чтобы проверить эффективность ингибиторов фибриноген значения взаимодействия, мы оптимизировали два метода для анализа в vitro сгустков фибрина: сгусток мутность пробирного и сканирование электронная микроскопия (SEM)14.
Сгусток мутность пробирного является прямой и быстрый метод для мониторинга сгустков фибрина с помощью УФ видимые спектроскопии. Как сгусток фибрина чаще рассеивается формы, света и помутнение раствора увеличивается. И наоборот, когда значения присутствует, изменяется структура фибринового сгустка, и помутнения смеси снижается (рис. 1). Эффект ингибирующее соединений можно оценить потенциал для восстановления сгусток мутности от значения индуцированной аномалии. Хотя мутность assay позволяет для быстрого анализа нескольких условий, предоставляет ограниченные сведения о сгусток формы и структуры. SEM, в котором топографии твердых объектов раскрывается зондом электрона, позволяет для анализа 3D архитектура сгусток15,16,17,18 и оценки как наличие значения и ингибирующее соединений или изменяет что структура9,14. Оба-спектрометрии и SEM классических лабораторных методов, используемых для различных целей, например, спектрофотометрия используется для мониторинга амилоида агрегации19,20. Аналогичным образом SEM также используется для анализа фибринового сгустка, образуются из плазмы Альцгеймера, Паркинсона и тромбоэмболических инсульт пациентов21,,22–23. Здесь представлены протоколы оптимизированы для оценки сгустков фибрина воспроизводимость и быстрым образом.
Следующий протокол содержит инструкции для подготовки в vitro фибрин сгусток с и без значения. В нем также подробно методы для анализа влияния значения на сгустков фибрина и структуры. Эффективность этих двух методов для измерения ингибирование значения фибриноген взаимодействия подтверждается с помощью TDI-2760, небольшой тормозящий составные14. Эти методы, как индивидуально, так и вместе, позволяют для быстрой и простой анализ формирования в vitro фибринового сгустка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанные здесь методы обеспечить воспроизводимость и быстрым средством оценки фибринового сгустка формирования в пробирке. Кроме того простота системы делает толкование как значения влияет на сгустков фибрина и структура довольно прямо вперед. В предыдущей публикации этой лаб…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Masanori Кавасаки, Кадзуёси Асо и Майкл Фоли от Tri-институциональные терапии Discovery институт (TDI), Нью-Йорк для синтеза ингибиторов фибриноген значения взаимодействия и их ценные предложения. Авторы также поблагодарить членов Стрикленд лаборатории для полезной дискуссии. Эта работа была поддержана NIH Грант NS104386, Фонд обнаружения наркотиков Альцгеймера и Робертсон терапевтического фонда развития для Х.А., низ Грант NS50537, Tri-институциональные терапии Discovery институт, Фонд обнаружения наркотиков Альцгеймера, Фонд семьи Рудин и Джон а. Херрманна по с.с.
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer’s disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer’s disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer’s disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer’s disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer’s disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer’s disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer’s disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson’s disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
