Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie
Summary
Hier sind zwei Methoden, die einzeln oder in Kombination verwendet werden können, um die Wirkung von Beta-Amyloid auf Fibrin Gerinnsel Struktur zu analysieren. Enthalten ist ein Protokoll für die Schaffung einer in Vitro Fibrin Gerinnsel, gefolgt von Gerinnsel Trübung und Rasterelektronenmikroskopie Methoden.
Abstract
Dieser Artikel stellt Methoden zur Erzeugung von in Vitro Fibrin Gerinnsel und Analyse der Wirkung von Beta-Amyloid (Aβ)-Protein auf Bildung von Blutgerinnseln und Struktur durch Spektrometrie und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Aβ, die neurotoxischen Amyloid Aggregate bei der Alzheimer-Krankheit (AD) bildet, hat sich gezeigt, zur Interaktion mit Fibrinogen. Dieses Zusammenspiel von Aβ-Fibrinogen macht das Fibrin-Gerinnsel strukturell abnorme und Fibrinolyse. Aβ-induzierte Anomalien in Fibrin Blutgerinnung können auch dazu beitragen, zerebrovaskuläre Aspekte der AD Pathologie wie Microinfarcts, Entzündungen sowie zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA). Angesichts der potenziell kritische Rolle der neurovaskulären Defizite in der AD-Pathologie, hat Verbindungen hemmen oder vermindern die Aβ-Fibrinogen-Interaktion zu entwickeln vielversprechenden therapeutischen Wert. In-vitro- Methoden nach dem Fibrin Gerinnselbildung leicht und systematisch beurteilt werden kann sind potenziell nützliche Werkzeuge für die Entwicklung von therapeutischen Substanzen. Hier vorgestellten ist ein optimierte Protokoll für in-vitro- Erzeugung von Fibrin-Gerinnsel sowie Analyse der Wirkung von Aβ und Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren. Die Gerinnsel Trübung Assay ist schnelle und hoch reproduzierbare und kann verwendet werden, um mehrere Bedingungen gleichzeitig testen, zulassend die Vorführung einer großen Zahl von Aβ-Fibrinogen-Inhibitoren. Hit-Verbindungen aus diesem Screening können weiter für ihre Fähigkeit, Aβ-induzierte strukturelle Anomalien der Fibrin-Gerinnsel-Architektur mit SEM verbessern ausgewertet werden Die Wirksamkeit dieser optimierte Protokolle ist hier demonstriert mit TDI-2760, eine neu identifizierte Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitor.
Introduction
Alzheimer-Krankheit (AD), ergibt sich eine Neurodegenerative Erkrankung führt zu kognitiven Verfall bei älteren Patienten, überwiegend aus abnorme Beta-Amyloid (Aβ) Ausdruck, Aggregation und eingeschränkter Freiraum was zu Neurotoxizität1, 2. trotz der gut-gekennzeichneten Assoziation zwischen Aβ-Aggregate und AD3, sind die genauen Mechanismen der Krankheit-Pathologie nicht gut verstanden4. Erhöhung der Beweis schlägt vor, dass neurovaskuläre Defizite bei der Progression und Schweregrad der AD5, eine Rolle spielen wie Aβ direkt mit den Komponenten des Herz-Kreislauf-System6 interagiert. Aβ hat eine hohe Affinität Interaktion mit Fibrinogen7,8, die auch zu Aβ Ablagerungen bei Alzheimer-Patienten und Maus Modelle9,10,11lokalisiert. Darüber hinaus induziert die Aβ-Fibrinogen-Interaktion abnorme Fibrin-Klumpenbildung sowie Struktur und Widerstand gegen die Fibrinolyse9,12. Eine therapeutische Möglichkeit bei der Behandlung von AD, ist Kreislauf Defizite durch die Hemmung der Interaktion zwischen Aβ und Fibrinogen13,14Linderung. Wir, identifiziert daher mehrere kleine Verbindungen hemmen die Aβ-Fibrinogen-Interaktion mit Hochdurchsatz-Screening und medizinische Chemie Ansätze13,14. Um die Wirksamkeit von Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren zu testen, haben wir zwei Methoden für die Analyse von in-vitro- Bildung von Blutgerinnseln Fibrin optimiert: Blutgerinnung Trübung Assay und Scannen Rasterelektronenmikroskopie (SEM)14.
Gerinnsel Trübung-Assay ist eine unkomplizierte und schnelle Methode zur Überwachung der Bildung von Blutgerinnseln Fibrin mit UV-VIS Spektroskopie. Als das Fibrin-Gerinnsel wird zunehmend Formen, Licht gestreut und die Trübung der Lösung erhöht. Umgekehrt, wenn Aβ vorhanden ist, die Struktur der das Fibrin-Gerinnsel wird geändert, und die Trübung des Gemisches wird reduziert (Abbildung 1). Die Wirkung von hemmenden Verbindungen kann das Potenzial Gerinnsel Trübung von Aβ-induzierte Anomalien wiederherstellen beurteilt werden. Während die Trübung Assay für die schnelle Analyse von mehreren Bedingungen ermöglicht, informiert es begrenzt auf die Gerinnsel Form und Struktur. SEM, in dem die Topographie von festen Körpern von Elektron Sonde offenbart, ermöglicht die Analyse der 3D-Architektur der Gerinnsel15,16,17,18 und die Bewertung wie das Vorhandensein von Aβ und und/oder hemmende Verbindungen verändert die Struktur9,14. Beide Spektrometrie und SEM sind klassische Labor-Techniken, die für verschiedene Zwecke verwendet wurden, z. B. Spektralphotometrie dient zur Überwachung von Amyloid Aggregation19,20. Ebenso dient SEM auch Fibrin Gerinnsel gebildet aus dem Plasma von Alzheimer, Parkinson und thromboembolische Schlaganfall Patienten21,22,23zu analysieren. Die hier vorgestellten Protokolle sind für die Beurteilung der Fibrin-Gerinnselbildung in einer reproduzierbaren und schnelle Art und Weise optimiert.
Das folgende Protokoll enthält die Anweisungen für die Zubereitung von einer in-Vitro Fibrin-Gerinnsel sowohl mit als auch ohne Aβ. Es beschreibt auch die Methoden, um die Wirkung von Aβ auf Bildung von Blutgerinnseln Fibrin und Struktur zu analysieren. Die Wirksamkeit dieser beiden Methoden für die Messung der Hemmung der Aβ-Fibrinogen Interaktion wird demonstriert mit TDI-2760, eine kleine hemmende Verbindung14. Diese Methoden können sowohl einzeln als auch gemeinsam, für schnelle und einfache Analyse von in-vitro- Bildung von Blutgerinnseln Fibrin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Methoden bieten eine reproduzierbare und schnelles Mittel zur Bewertung der Fibrin Gerinnsel Bildung in Vitro. Darüber hinaus macht die Einfachheit des Systems die Interpretation der Auswirkungen Aβ die Bildung von Blutgerinnseln Fibrin und Struktur relativ geradlinig. In dieser Übungseinheit früheren Publikation zeigte sich, dass diese Tests verwendet werden, können um Verbindungen für ihre Fähigkeit, hemmen die Aβ-Fibrinogen Interaktion13,<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autoren danken Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso und Michael Foley von Tri-Institutionelle Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York für die Synthese von Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren und ihre wertvollen Anregungen. Autoren auch danken Mitgliedern des Strickland Labor für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde von NIH Grant NS104386, der Alzheimers Drug Discovery Foundation und Robertson therapeutische Entwicklungsfonds für H.A., unterstützt NIH grant NS50537, Tri-Institutionelle Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation und John A. Herrmann für S.S.
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer’s disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer’s disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer’s disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer’s disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer’s disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer’s disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer’s disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson’s disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
