تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني
Summary
المقدمة هنا هي اثنين من الأساليب التي يمكن استخدامها منفردة أو مجتمعة لتحليل أثر بيتا-اميلويد على هيكل فيبرينوجين جلطة. وشملت بروتوكول لإنشاء في المختبر فيبرينوجين جلطة، تليها التعكر تجلط والمجهر الإلكتروني المسح أساليب.
Abstract
تعرض هذه المقالة طرق لتوليد في المختبر فيبرينوجين جلطات وتحليل تأثير بروتين اميلويد بيتا (Aβ) على تشكيل جلطة وهيكل بقياس الطيف الكتلي والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM). لقد ثبت Aβ، التي تشكل مجاميع اميلويد الأعصاب في مرض الزهايمر (AD)، للتفاعل مع الفيبرينوجين. يجعل هذا التفاعل Aβ-الفيبرينوجين تجلط فيبرينوجين هيكلياً غير طبيعي ومقاومة ل fibrinolysis. التشوهات الناجمة عن Aβ في تخثر فيبرينوجين قد تسهم أيضا في جوانب المخية الباثولوجي الإعلانية مثل ميكروينفاركتس، التهاب، فضلا عن أنجيوباثي اميلويد الدماغي (هيئة الطيران المدني). نظراً للدور الحاسم يحتمل أن العجز في نيوروفاسكولار في الباثولوجيا الإعلانية، تطوير المركبات التي يمكن أن تمنع أو تقلل من التفاعل Aβ-الفيبرينوجين له قيمة علاجية واعدة. في المختبر الأساليب التي فيها فيبرينوجين تشكيل جلطة يمكن بسهولة ومنهجية تقييم أدوات يمكن أن تكون مفيدة لتطوير المركبات العلاجية. قدم هنا بروتوكول أمثل لجيل في المختبر من جلطة فيبرينوجين، فضلا عن تحليل لتأثير مثبطات التفاعل Aβ و Aβ-الفيبرينوجين. مقايسة التعكر تجلط السريع، واستنساخه بدرجة عالية، ويمكن استخدامها لاختبار شروط متعددة في وقت واحد، مما يسمح لفحص عدد كبير من مثبطات Aβ-الفيبرينوجين. ويمكن تقييم ضرب المركبات من هذا الفحص كذلك لقدرتها على التخفيف من التشوهات الهيكلية المستحثة Aβ فيبرينوجين جلطة البنية باستخدام sem. وأظهرت فعالية هذه البروتوكولات الأمثل هو هنا استخدام TDI-2760، مثبط تفاعل Aβ-الفيبرينوجين التي تم تحديدها مؤخرا.
Introduction
مرض الزهايمر (AD)، مرض الأعصاب مما يؤدي إلى التدهور المعرفي في المرضى المسنين، يغلب عليها الطابع ينبع من التعبير (Aβ) بيتا-اميلويد الشاذ والتجميع والتخليص البصر أدى إلى تسمم1، 2-على الرغم من الرابطة تميز جيدا بين المجاميع Aβ والإعلان3، الآليات الدقيقة الكامنة وراء باثولوجيا المرض ليست مفهومة جيدا4. تزايد الأدلة تقترح أن العجز neurovascular تلعب دوراً في تطور وشدة5من الإعلان، كما Aβ تتفاعل مباشرة مع مكونات نظام الدورة الدموية6. وقد Aβ إلى تفاعل عالية تقارب مع الفيبرينوجين7،8، الذي يموضع أيضا رواسب Aβ المرضى الإعلانية والماوس نماذج9،،من1011. وعلاوة على ذلك، يدفع التفاعل Aβ-الفيبرينوجين تشكيل جلطة فيبرينوجين الشاذ والهيكل، فضلا عن مقاومة فيبرينوليسيس9،12. أحد الاحتمالات العلاجية في علاج الإعلانية، هو التخفيف من حدة العجز في الدورة الدموية عن طريق تثبيط التفاعل بين13،Aβ والفيبرينوجين14. ولذلك، حددنا عدة مركبات الصغيرة التي تعوق التفاعل Aβ-الفيبرينوجين باستخدام فحص إنتاجية عالية والكيمياء الطبية النهج13،14. لاختبار فعالية مثبطات التفاعل Aβ-الفيبرينوجين، نحن الأمثل طريقتين للتحليل في المختبر فيبرينوجين جلطة تشكيل: تجلط التعكر المقايسة، وفحص المجهر الإلكتروني (SEM)14.
تجلط التعكر المقايسة أسلوب مستقيم إلى الأمام والسريع لرصد فيبرينوجين جلطة تكوين باستخدام مطيافية الأشعة فوق البنفسجية-المرئية. متزايدة مبعثرة تجلط فيبرينوجين أشكال، الخفيفة ويزيد من التعكر للحل. على العكس من ذلك، عندما Aβ غير موجود، يتم تغيير هيكل تجلط فيبرينوجين، وتقليل التعكر المخلوط (الشكل 1). ويمكن تقييم تأثير المركبات المثبطة لإمكانية استعادة التعكر جلطة من التشوهات الناجمة عن Aβ. حين المقايسة التعكر يسمح للتحليل السريع لظروف متعددة، فإنه يوفر معلومات محدودة عن تجلط الشكل والهيكل. ووزارة شؤون المرأة، التي كشفت طبوغرافية الأجسام الصلبة بمسبار الإلكترون، يسمح بتحليل بنية ثلاثية الأبعاد بجلطة15،16،،من1718 وتقييم كيفية وجود Aβ و المركبات المثبطة أو يغير هذا الهيكل9،14. كل قياس الطيف الكتلي ووزارة شؤون المرأة هي التقنيات المختبرية الكلاسيكية التي استخدمت لأغراض مختلفة، على سبيل المثال، كانت تستخدم لرصد تراكم اميلويد19،20. وبالمثل، يستخدم أيضا وزارة شؤون المرأة لتحليل فيبرينوجين جلطة تكونت من البلازما من مرض الزهايمر، باركنسون والسكتة الدماغية انصماميه المرضى21،،من2223. البروتوكولات المقدمة هنا هي الأمثل لتقييم تكوين فيبرينوجين جلطة بطريقة سريعة واستنساخه.
ويوفر البروتوكول التالي التعليمات الخاصة بإعداد في المختبر فيبرينوجين-كلوت على حد سواء مع ودون Aβ. أنها أيضا تفاصيل أساليب لتحليل تأثير Aβ على تشكيل جلطة فيبرينوجين والهيكل. هو أظهرت فعالية هاتين الطريقتين لقياس تثبيط التفاعل Aβ-الفيبرينوجين باستخدام مؤشر التجارة والتنمية-2760، مجمع مثبطة صغيرة14. هذه الأساليب، كل على حدة ومعا، تسمح بتحليل في المختبر فيبرينوجين جلطة تشكيل سريع ومباشر.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب الموصوفة هنا توفر وسيلة سريعة واستنساخه لتقييم فيبرينوجين جلطة تشكيل في المختبر. وعلاوة على ذلك، بساطة النظام يجعل تفسير كيف يؤثر Aβ فيبرينوجين جلطة تكوين وهيكل نسبيا على التوالي إلى الأمام. في منشور سابق هذا المعمل، وقد تبين أنه يمكن استخدام هذه الاختبارات لاختبار المركبا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون كاواساكي ماسانوري واسو كازويوشي مايكل فولي من معهد ديسكفري المداواة الثلاثية المؤسسية (TDI) ونيويورك لتوليف مثبطات التفاعل Aβ-الفيبرينوجين ومقترحاتهم القيمة. يشكر المؤلفون أيضا أعضاء المختبر ستريكلاند لمناقشة مفيدة. تم دعم هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة منحة NS104386، ومؤسسة اكتشاف المخدرات مرض الزهايمر، وصندوق التنمية العلاجية روبرتسون إتش، المعاهد الوطنية للصحة منح NS50537، المعهد اكتشاف العلاجات ثلاثي المؤسسية، “مؤسسة اكتشاف المخدرات” مرض الزهايمر، مؤسسة عائلة Rudin، وهيرمان جون أ عن س. س.
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
- Selkoe, D. J., Schenk, D. Alzheimer’s disease: molecular understanding predicts amyloid-based therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 43, 545-584 (2003).
- Kurz, A., Perneczky, R. Amyloid clearance as a treatment target against Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 24, 61-73 (2011).
- Benilova, I., Karran, E., De Strooper, B. The toxic Abeta oligomer and Alzheimer’s disease: an emperor in need of clothes. Nature Neuroscience. 15 (3), 349-357 (2012).
- Karran, E., Hardy, J. A critique of the drug discovery and phase 3 clinical programs targeting the amyloid hypothesis for Alzheimer disease. Annals of Neurology. 76 (2), 185-205 (2014).
- Yoshikawa, T., et al. Heterogeneity of cerebral blood flow in Alzheimer disease and vascular dementia. AJNR, American Journal of Neuroradiology. 24 (7), 1341-1347 (2003).
- Strickland, S. Blood will out: vascular contributions to Alzheimer’s disease. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 556-563 (2018).
- Ahn, H. J., et al. Alzheimer’s disease peptide beta-amyloid interacts with fibrinogen and induces its oligomerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21812-21817 (2010).
- Zamolodchikov, D., et al. Biochemical and structural analysis of the interaction between beta-amyloid and fibrinogen. Blood. 128 (8), 1144-1151 (2016).
- Cortes-Canteli, M., et al. Fibrinogen and beta-amyloid association alters thrombosis and fibrinolysis: a possible contributing factor to Alzheimer’s disease. Neuron. 66 (5), 695-709 (2010).
- Cortes-Canteli, M., Mattei, L., Richards, A. T., Norris, E. H., Strickland, S. Fibrin deposited in the Alzheimer’s disease brain promotes neuronal degeneration. Neurobiology of Aging. 36 (2), 608-617 (2015).
- Liao, L., et al. Proteomic characterization of postmortem amyloid plaques isolated by laser capture microdissection. The Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 37061-37068 (2004).
- Zamolodchikov, D., Strickland, S. Abeta delays fibrin clot lysis by altering fibrin structure and attenuating plasminogen binding to fibrin. Blood. 119 (14), 3342-3351 (2012).
- Ahn, H. J., et al. A novel Abeta-fibrinogen interaction inhibitor rescues altered thrombosis and cognitive decline in Alzheimer’s disease mice. The Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1049-1062 (2014).
- Singh, P. K., et al. Aminopyrimidine Class Aggregation Inhibitor Effectively Blocks Abeta-Fibrinogen Interaction and Abeta-Induced Contact System Activation. Biochemistry. 57 (8), 1399-1409 (2018).
- Pretorius, E., Mbotwe, S., Bester, J., Robinson, C. J., Kell, D. B. Acute induction of anomalous and amyloidogenic blood clotting by molecular amplification of highly substoichiometric levels of bacterial lipopolysaccharide. Journal of the Royal Society Interface. 13 (122), (2016).
- Veklich, Y., Francis, C. W., White, J., Weisel, J. W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 92 (12), 4721-4729 (1998).
- Weisel, J. W., Nagaswami, C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophysical Journal. 63 (1), 111-128 (1992).
- Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879 (2012).
- Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. Quantifying amyloid beta-peptide (Abeta) aggregation using the Congo red-Abeta (CR-abeta) spectrophotometric assay. Analytical Biochemistry. 266 (1), 66-76 (1999).
- Zhao, R., et al. Measurement of amyloid formation by turbidity assay-seeing through the cloud. Biophysical Reviews. 8 (4), 445-471 (2016).
- Bester, J., Soma, P., Kell, D. B., Pretorius, E. Viscoelastic and ultrastructural characteristics of whole blood and plasma in Alzheimer-type dementia, and the possible role of bacterial lipopolysaccharides (LPS). Oncotarget. 6 (34), 35284-35303 (2015).
- Pretorius, E., Page, M. J., Mbotwe, S., Kell, D. B. Lipopolysaccharide-binding protein (LBP) can reverse the amyloid state of fibrin seen or induced in Parkinson’s disease. PLoS One. 13 (3), e0192121 (2018).
- Kell, D. B., Pretorius, E. Proteins behaving badly. Substoichiometric molecular control and amplification of the initiation and nature of amyloid fibril formation: lessons from and for blood clotting. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 123, 16-41 (2017).
- Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38 (1), 15-23 (2008).
- Soon, A. S., Lee, C. S., Barker, T. H. Modulation of fibrin matrix properties via knob:hole affinity interactions using peptide-PEG conjugates. Biomaterials. 32 (19), 4406-4414 (2011).
