Analyse des anomalies induite par la β-amyloïde sur Structure de caillot de fibrine par spectroscopie et microscopie électronique à balayage
Summary
Présentées ici sont deux méthodes qui peuvent être utilisés individuellement ou en combinaison pour analyser l’effet de la protéine bêta-amyloïde sur structure de caillot de fibrine. Inclus est un protocole créant un caillot de fibrine in vitro , suivie de turbidité de caillot et la microscopie électronique à balayage méthodes.
Abstract
Cet article présente des méthodes pour générer des caillots de fibrine in vitro et analyser l’effet de la protéine de bêta-amyloïde (Aß) sur la formation de caillots et de la structure par spectrométrie et microscopie électronique (MEB). Bêta-amyloïdes, qui forme des agrégats amyloïdes neurotoxiques dans la maladie d’Alzheimer (ma), s’est avéré d’interagir avec le fibrinogène. Cette interaction Aβ-fibrinogène rend le caillot de fibrine structurellement anormale et résistant à la fibrinolyse. Induite par l’Aß anomalies de coagulation de la fibrine peuvent aussi contribuer aux aspects cérébro-vasculaires de la pathologie AD tels que microinfarcts, l’inflammation, ainsi que, angiopathie amyloïde (CAA). Étant donné le rôle potentiellement critique des déficits neurovasculaire dans la pathologie de la ma, développement de composés qui peuvent inhiber ou réduire l’interaction Aβ-fibrinogène a une valeur thérapeutique prometteuse. Méthodes in vitro par lequel fibrine la formation de caillots peut être facilement et systématiquement évaluée sont des outils potentiellement utiles pour développer des composés thérapeutiques. Présenté ici est un protocole optimisé pour in vitro génération du caillot de fibrine, ainsi que l’analyse de l’effet des inhibiteurs d’interaction Aβ et Aβ-fibrinogène. Le test de turbidité de caillot est rapide, hautement reproductible et peut être utilisé pour tester plusieurs conditions en même temps, ce qui permet la projection d’un grand nombre d’inhibiteurs d’Aβ-fibrinogène. Succès composés de ce dépistage peuvent être évaluées davantage pour leur capacité à améliorer Aβ-induit des anomalies structurelles de l’architecture de caillot de fibrine à l’aide de SEM L’efficacité de ces protocoles optimisés est démontrée ici en utilisant TDI-2760, un inhibiteur d’interaction Aβ-fibrinogène identifié récemment.
Introduction
Maladie d’Alzheimer (ma), une maladie neurodégénérative conduisant à un déclin cognitif chez les personnes âgées, majoritairement découle anormale bêta-amyloïde (Aß) expression, d’agrégation et dégagement ayant une déficience entraînant neurotoxicité1, 2. Malgré l’association bien caractérisée entre les agrégats de bêta-amyloïdes et AD3, les mécanismes précis qui sous-tendent la pathologie de la maladie ne sont pas bien compris4. Plus en plus évident suggère que les déficits neurovasculaires jouent un rôle dans la progression et la sévérité des AD5, comme Aβ interagit directement avec les composants de l’ appareil circulatoire6. Bêta-amyloïdes a une interaction de forte affinité avec le fibrinogène7,8, qui localise également aux dépôts de bêta-amyloïdes dans les patients de l’AD et les souris modèles9,10,11. Par ailleurs, l’interaction Aβ-fibrinogène induit la formation de caillot de fibrine anormale et structure, ainsi que la résistance à la fibrinolyse9,12. Une des possibilités thérapeutiques dans le traitement de la ma est atténuer les déficits circulatoires en inhibant l’interaction entre Aβ et fibrinogène13,14. Nous avons, par conséquent, identifié plusieurs petits composés inhibant l’interaction Aβ-fibrinogène à l’aide de criblage à haut débit et la chimie médicinale approches13,14. Pour tester l’efficacité des inhibiteurs de l’interaction Aβ-fibrinogène, nous avons optimisé les deux méthodes d’analyse de in vitro formation de caillots de fibrine : coagulation test de turbidité et scanning electron microscopy (SEM)14.
Test de turbidité de caillot est une méthode simple et rapide pour le suivi de formation de caillots de fibrine en utilisant la spectroscopie UV-visible. Tant que le caillot de fibrine, formes, lumière est plus en plus dispersés et la turbidité de la solution augmente. À l’inverse, lorsque Aβ est présent, la structure du caillot de fibrine est altérée et la turbidité du mélange est réduite (Figure 1). L’effet des composés inhibiteurs peut être évaluée pour le potentiel de restaurer caillot turbidité d’anomalies induite par l’Aß. Alors que le test de turbidité permet pour l’analyse rapide des conditions multiples, il fournit des informations limitées sur le caillot forme et la structure. SEM, dans lequel la topographie des objets solides est révélée par la sonde électronique, permettant l’analyse de l’architecture 3D du caillot15,16,17,18 et l’évaluation de la façon dont la présence de bêta-amyloïdes et composés inhibiteurs et/ou modifie cette structure9,14. Les deux spectrométrie et SEM sont des techniques de laboratoire classiques qui ont été utilisés à diverses fins, par exemple, spectrophotométrie est utilisée pour surveiller l’agrégation amyloïde19,20. De même, SEM est également utilisé pour analyser le caillot de fibrine formé à partir du plasma de l’Alzheimer, Parkinson et maladies thrombo-emboliques patients21,22,23. Les protocoles présentés ici sont optimisés pour l’évaluation de la formation de caillot de fibrine de façon reproductible et rapide.
Le protocole suivant fournit les instructions pour la préparation d’un in vitro -caillot de fibrine avec et sans Aβ. Il détaille également les méthodes pour analyser l’effet des bêta-amyloïdes sur la formation de caillots de fibrine et de la structure. L’efficacité de ces deux méthodes pour mesurer l’inhibition de l’interaction d’Aβ-fibrinogène est démontrée à l’aide de TDI-2760, un petit composé inhibiteur14. Ces méthodes, individuellement et ensemble, permettent une analyse rapide et simple de in vitro formation de caillots de fibrine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes décrites ici constituent un moyen reproductible et rapid d’évaluation de fibrine caillot formation in vitro. En outre, la simplicité du système rend l’interprétation de la façon dont Aβ affecte la formation de caillots de fibrine et la structure relativement simple. La dernière publication de ce laboratoire, il a été démontré que ces tests peuvent servir à tester les composés pour leur capacité à inhiber l’Aβ-fibrinogène interaction13,<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs remercient Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso et Michael Foley de Tri-institutionnels Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York pour la synthèse d’inhibiteurs d’interaction Aβ-fibrinogène et leurs précieuses suggestions. Auteurs remercient également les membres du laboratoire Strickland de discussion utile. Ce travail a été soutenu par les NIH grant NS104386, Alzheimer Drug Discovery Foundation et fonds de développement thérapeutique Robertson pour H.A., NIH grant NS50537, la Tri-institutionnels Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation et John A. Herrmann pour la S.S.
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
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