Análise de β-amiloide-induzida de anormalidades na estrutura do coágulo de fibrina por espectroscopia e microscopia eletrônica
Summary
Aqui apresentados são dois métodos que podem ser usados individualmente ou em combinação para analisar o efeito da beta-amiloide na estrutura do coágulo de fibrina. Incluído é um protocolo para criar um em vitro coágulo de fibrina, seguido pelo coágulo turbidez e microscopia eletrônica métodos.
Abstract
Este artigo apresenta métodos para gerar coágulos de fibrina em vitro e analisando o efeito da proteína de beta-amiloide (Aβ) na formação de coágulos e estrutura por espectrometria e microscopia eletrônica (SEM). Aβ, que forma neurotóxicos agregados amiloides na doença de Alzheimer (AD), foi mostrado para interagir com o fibrinogênio. Essa interação de Aβ-fibrinogênio faz o coágulo de fibrina estruturalmente anormal e resistente a fibrinólise. Induzida por aβ anormalidades na coagulação fibrina também podem contribuir para aspectos cerebrovasculares da patologia AD tais como microinfarcts, inflamação, bem como, Angiopatia amiloide cerebral (CAA). Dado o papel potencialmente crítico dos défices neurovasculares na patologia AD, desenvolvimento de compostos que podem inibir ou diminuir a interação de Aβ-fibrinogênio tem valor terapêutico promissor. Métodos in vitro pelo qual fibrina formação do coágulo pode ser facilmente e sistematicamente avaliada são potencialmente úteis ferramentas para o desenvolvimento de compostos terapêuticos. Apresentado aqui é um protocolo otimizado para in vitro geração do coágulo de fibrina, bem como a análise do efeito dos inibidores de interação Aβ e Aβ-fibrinogênio. O ensaio de turbidez do coágulo é rápida, altamente reprodutível e pode ser usado para testar várias condições simultaneamente, permitindo a seleção de um grande número de inibidores de Aβ-fibrinogênio. Sucesso compostos desta seleção podem ser mais avaliados por sua capacidade de amenizar induzida por Aβ anormalidades estruturais da arquitetura do coágulo de fibrina usando SEM. A eficácia destes protocolos otimizado é demonstrada aqui usando TDI-2760, um inibidor de interação de Aβ-fibrinogênio recentemente identificado.
Introduction
A doença de Alzheimer (AD), uma doença neurodegenerativa, levando ao declínio cognitivo em pacientes idosos, predominantemente decorre anormal expressão de beta-amiloide (Aβ), agregação e liberação prejudicada, resultando em neurotoxicidade1, 2. apesar da associação bem caracterizada entre agregados Aβ e AD3, os mecanismos precisos subjacentes a patologia da doença não são bem compreendidas4. Aumentando a evidência sugere que os défices neurovascular desempenham um papel na progressão e gravidade da AD5, como Aβ interage diretamente com os componentes do sistema circulatório6. Aβ tem uma interação de alta afinidade com fibrinogênio7,8, que localiza também aos depósitos Aβ em pacientes AD e rato modelos9,10,11. Além disso, a interação de Aβ-fibrinogênio induz a formação do coágulo de fibrina anormal e estrutura, bem como resistência a fibrinólise9,12. Uma possibilidade terapêutica no tratamento de AD, está aliviando o déficit circulatório, inibindo a interação entre Aβ e fibrinogênio13,14. Nós, portanto, identificamos vários pequenos compostos, inibindo a interação de Aβ-fibrinogênio usando alto throughput triagem e química medicinal abordagens13,14. Para testar a eficácia de inibidores de interação Aβ-fibrinogênio, nós aperfeiçoamos a dois métodos de análise de em vitro formação de coágulos de fibrina: coagular ensaio de turbidez e digitalização de microscopia eletrônica de varredura (MEV)14.
Ensaio de turbidez de coágulo é um método direto e rápido para monitorar a formação de coágulos de fibrina usando espectroscopia UV-visível. Como o coágulo de fibrina, formas, luz é cada vez mais dispersos e a turbidez da solução aumenta. Inversamente, quando Aβ está presente, a estrutura do coágulo de fibrina é alterada, e a turvação da mistura é reduzida (Figura 1). O efeito inibitório compostos pode ser avaliado para o potencial de restaurar o coágulo turbidez de anormalidades Aβ-induzida. Enquanto o ensaio de turbidez permite análise rápida de várias condições, fornece informações limitadas sobre a forma de coágulo e estrutura. SEM, em que a topografia de objetos sólidos é revelada pela sonda de elétron, permite a análise da arquitetura 3D do coágulo16,15,17,18 e a avaliação de como a presença de Aβ e / ou compostos inibitórios altera essa estrutura9,14. Tanto espectrometria e SEM são técnicas clássicas de laboratório que foram usadas para diversos fins, por exemplo, espectrofotometria usada para monitorar a agregação amiloide19,20. Da mesma forma, SEM também é usado para analisar o coágulo de fibrina formado a partir do plasma do Alzheimer, Parkinson e AVC tromboembólico pacientes21,22,23. Os protocolos aqui apresentados são otimizados para avaliar a formação do coágulo de fibrina de forma rápida e reprodutível.
O protocolo seguinte fornece as instruções para a preparação de um em vitro -coágulo de fibrina com e sem Aβ. Ele também detalha os métodos para analisar o efeito de Aβ na formação do coágulo de fibrina e estrutura. A eficácia destes dois métodos para medir a inibição da interação Aβ-fibrinogênio é demonstrada usando TDI-2760, um pequeno compostos inibitórios14. Esses métodos, tanto individualmente e em conjunto, permitem uma análise rápida e simples de em vitro formação de coágulos de fibrina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos descritos aqui fornecem um meio rápido e reprodutível de avaliação fibrina coágulo formação em vitro. Além disso, a simplicidade do sistema torna a interpretação de como Aβ afeta a formação do coágulo de fibrina e estrutura relativamente simples e direta. Na publicação anterior deste laboratório, foi mostrado que estes ensaios podem ser usados para testar compostos por sua capacidade de inibir a interação de Aβ-fibrinogênio13,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autores agradecer Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso e Michael Foley de Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute (TDI), Nova York para a síntese dos inibidores de interação Aβ-fibrinogênio e suas valiosas sugestões. Os autores também agradecer membros do laboratório Strickland para discussão útil. Este trabalho foi financiado pelo NIH grant NS104386, Drug Discovery Foundation do Alzheimer e fundo de desenvolvimento terapêutico Robertson para H.A., NIH conceder NS50537, Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Fundação da família de Rudin e John A. Herrmann para S.S.
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
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