Análisis de anomalías inducida por β-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina por espectroscopía y microscopía electrónica de barrido
Summary
Presentados aquí son dos métodos que pueden utilizarse individualmente o en combinación para analizar el efecto de beta-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina. Incluido es un protocolo para crear un coágulo de fibrina en vitro , y después coágulo turbidez y microscopía electrónica métodos.
Abstract
Este artículo presenta métodos para la generación de coágulos de fibrina vitro y analizar el efecto de la proteína de amiloide beta (Aβ) en estructura y formación de coágulos por espectrometría y microscopía electrónica de barrido (SEM). Aβ, que forma agregados de amiloide neurotóxicos en enfermedad de Alzheimer (EA), se ha demostrado para interactuar con el fibrinógeno. Esta interacción de Aβ-fibrinógeno hace el coágulo de fibrina estructuralmente anormales y resistentes a la fibrinólisis. Inducida por Aß anormalidades en la coagulación de fibrina también pueden contribuir a aspectos cerebrovasculares de la patología de AD como microinfartos, inflamación, así como, angiopathy amiloideo cerebral (CAA). Dado el papel potencialmente crítico de déficit neurovascular en patología AD, desarrollo de compuestos que pueden inhibir o reducir la interacción de fibrinógeno Aβ tiene valor terapéutico prometedor. In vitro métodos por que fibrina formación de coágulos puede ser fácil y sistemáticamente evaluada son herramientas potencialmente útiles para el desarrollo de compuestos terapéuticos. Presentamos es un protocolo optimizado para generación en vitro del coágulo de fibrina, así como análisis del efecto de inhibidores de la interacción de Aß y el Aβ-fibrinógeno. El análisis de turbidez de coágulo es rápido, altamente reproducible y puede utilizarse para probar condiciones múltiples simultáneamente, permitiendo la proyección de un gran número de inhibidores de la Aβ-fibrinógeno. Éxitos compuestos a partir de esta proyección pueden ser evaluados además por su capacidad para mejorar inducida por Aß anormalidades estructurales de la arquitectura del coágulo de fibrina mediante SEM. La eficacia de estos protocolos optimizados se demuestra aquí con TDI-2760, un inhibidor de interacción recientemente identificado de Aβ-fibrinógeno.
Introduction
La enfermedad de Alzheimer (AD), una enfermedad neurodegenerativa que lleva a deterioro cognitivo en pacientes ancianos, predominantemente surge de la expresión anormal beta-amiloide (Aβ), agregación y separación deteriorada, dando lugar a neurotoxicidad1, 2. a pesar de la Asociación bien caracterizada entre agregados de Aß y AD3, los mecanismos precisos subyacentes a la patología de la enfermedad no son bien entendidos4. Creciente evidencia sugiere que déficit neurovascular desempeñan un papel en la progresión y severidad de AD5, Aβ interactúa directamente con los componentes del sistema circulatorio6. Aβ tiene una interacción de alta afinidad con el fibrinógeno7,8, que también se localiza a los depósitos Aβ en pacientes con EA y ratón modelos9,10,11. Además, la interacción de fibrinógeno Aβ induce la formación anormal de coágulos de fibrina y estructura, así como resistencia a la fibrinolisis9,12. Una posibilidad terapéutica en el tratamiento de AD, es aliviar el déficit circulatorio mediante la inhibición de la interacción de Aß y fibrinógeno13,14. Por lo tanto, identificamos varios pequeños compuestos inhiben la interacción de fibrinógeno Aβ con proyección de alto rendimiento y química medicinal enfoques13,14. Para probar la eficacia de los inhibidores de la interacción de fibrinógeno de Aβ, hemos optimizado dos métodos para el análisis de en vitro la formación de coágulos de fibrina: coágulo turbidez análisis y exploración de la microscopia electrónica (SEM)14.
Análisis de turbidez de coágulo es un método sencillo y rápido para el seguimiento de la formación del coágulo de fibrina mediante espectroscopia UV-visible. Como el coágulo de fibrina se dispersa cada vez más formas, luz y aumenta la turbidez de la solución. Por el contrario, cuando Aß está presente, se altera la estructura del coágulo de fibrina, y se reduce la turbiedad de la mezcla (figura 1). El efecto de compuestos inhibitorios puede evaluarse el potencial restaurar coágulo turbidez de anormalidades inducidas por Aβ. Mientras que el análisis de turbidez permite un análisis rápido de varias condiciones, proporciona información limitada sobre el coágulo forma y estructura. SEM, en el que se revela la topografía de objetos sólidos por sonda de electrones, permite el análisis de la arquitectura 3D del coágulo15,16,17,18 y la evaluación de cómo la presencia de Aß y compuestos inhibitorios y/o altera esa estructura9,14. Tanto espectrometría y SEM son técnicas de laboratorio clásicas que se han utilizado para los varios propósitos, por ejemplo, espectrofotometría se utiliza para el control de la agregación amiloide19,20. Del mismo modo, SEM también se utiliza para analizar el coágulo de fibrina formado por el plasma de la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y accidente cerebrovascular tromboembólico pacientes21,22,23. Los protocolos aquí presentados están optimizados para evaluar la formación del coágulo de fibrina de forma rápida y reproducible.
El siguiente protocolo proporciona las instrucciones para la preparación de una en vitro -coágulo de fibrina con o sin Aβ. También detalla los métodos para analizar el efecto de Aß en la formación de coágulos de fibrina y estructura. La eficacia de estos dos métodos para medir la inhibición de la interacción de fibrinógeno Aβ se demuestra usando TDI-2760, un compuesto inhibitorio pequeño14. Estos métodos, tanto individualmente como en conjunto, permiten análisis rápido y sencillo de en vitro la formación de coágulos de fibrina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos aquí proporcionan un medio rápido y reproducible de evaluación fibrina coágulo formación en vitro. Además, la simplicidad del sistema hace que la interpretación de cómo Aß afecta la formación de coágulos de fibrina y la estructura relativamente sencilla. En publicación anterior de este laboratorio, se comprobó que estos ensayos pueden utilizarse para probar compuestos por su capacidad para inhibir la interacción de fibrinógeno Aβ13,<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autores agradecen Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso y Michael Foley de Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute (TDI), Nueva York para la síntesis de inhibidores de la interacción de fibrinógeno de Aß y sus valiosas sugerencias. Autores también agradecen a los miembros del laboratorio de Strickland para el debate útil. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH NS104386 de Alzheimer Drug Discovery Foundation y fondo de desarrollo terapéutico de Robertson para H.A., NIH grant NS50537, el Tri-institucional Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Fundación de la familia Rudin y John A. Herrmann de S.S.
Materials
| Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma | EMD Millipore | 341578 | keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture |
| Beta-Amyloid (1-42), Human | Anaspec | AS-20276 | |
| Thrombin from human plasma | Sigma-Aldrich | T7009 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99% | Sigma-Aldrich | 105228 | |
| DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Tris Base | Fischer Scientific | BP152 | |
| HEPES | Fischer Scientific | BP310 | |
| NaCl | Fischer Scientific | S271 | |
| CaCl2 | Fischer Scientific | C70 | |
| Filter Syringe, 0.2µM, 25mm | Pall | 4612 | |
| Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia. | Millipore | SLVV033RS | |
| Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom | Fischer Scientific | 21377203 | |
| Spectramax Plus384 | Molecular Devices | 89212-396 | |
| Centrifuge, 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| Branson 200 Ultrasonic Cleaner | Fischer Scientific | 15-337-22 | |
| Lab Rotator | Thermo Scientific | 2314-1CEQ | |
| Spare washers for cover slip holder | Tousimis | 8766-01 | |
| Narrow Stem Pipets – Sedi-Pet | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70967-13 | |
| Sample holder for CPD (Cover slip holder) | Tousimis | 8766 | |
| Mount Holder Box, Pin Type | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 76610 | |
| Round glass cover slides (12 mm) | Hampton Research | HR3-277 | |
| 10% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 16120 | |
| Ethanol | Decon Labs | 11652 | |
| 24 well plate | Falcon | 3047 | |
| Na Cacodylate | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 11652 | |
| SEM Stubs, Tapered end pin. | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 75192 | |
| PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD | Ted Pella | 16084-1 | |
| Autosamdri-815 Critical Point Dryer with Gold/Palladium target | Tousimis | ||
| Denton Desk IV Coater | Denton Vacuum | ||
| Leo 1550 FE-SEM | Carl Zeiss | ||
| Smart SEM Software | Carl Zeiss |
References
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