Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo
Summary
Qui, descriviamo 3 modelli di lesione di zebrafish adulto e loro uso combinato con il trattamento di droga immunosopressiva. Siamo fornire indicazioni su formazione immagine di rigenerare i tessuti e il rilevamento di mineralizzazione dell’osso in esso.
Abstract
Zebrafish sono in grado di rigenerare i vari organi, tra cui appendici (pinne) dopo l’amputazione. Ciò comporta la rigenerazione dell’osso, che ricresce entro circa due settimane dopo la ferita. Inoltre, zebrafish sono in grado di guarire rapidamente dell’osso dopo la trapanazione del cranio e riparare le fratture che possono essere facilmente introdotto nei raggi della pinna ossuta di zebrafish. Queste analisi di lesioni rappresentano fattibile paradigmi sperimentali per testare l’effetto dei farmaci somministrati su rapidamente formando dell’osso. Qui, descriviamo l’uso di questi modelli di 3 lesioni e loro uso combinato con il trattamento glucocorticoide sistemica, che esercita gli effetti immunosopressivi ed inibitoria dell’osso. Forniamo un flusso di lavoro su come prepararsi per il trattamento immunosopressivo in zebrafish adulto, illustrano come eseguire pinna amputazione, trapanazione delle ossa calvarial e fratture pinna e descrivere come l’uso di glucocorticoidi influenzano entrambi osso formazione osteoblasti e cellule della linea monocito/macrofago come parte dell’immunità innata nel tessuto osseo.
Introduction
Zebrafish rappresentano un potente modello animale per studiare la malattia e lo sviluppo dei vertebrati. Questo è dovuto al fatto che essi sono piccoli animali che si riproducono molto bene e che il loro genoma è completamente sequenziato e suscettibili di manipolazione1. Altri vantaggi includono la possibilità di eseguire imaging continuato dal vivo in diverse fasi, compreso formazione immagine in vivo di zebrafish adulto2e la possibilità di eseguire gli schermi della droga a resa elevata in zebrafish larve3. Inoltre, zebrafish possiedono un’elevata capacità rigenerativa in una varietà di organi e tessuti tra cui osso e così servire come un sistema utile per studiare la malattia scheletrica e riparare4,5.
Osteoporosi indotta da glucocorticoidi (GIO) è una malattia che deriva dal trattamento a lungo termine con glucocorticoidi, ad esempio nel corso del trattamento di malattia autoimmune come l’asma o l’artrite reumatoide. GIO si sviluppa in circa il 30% dei pazienti trattati con glucocorticoidi e rappresenta un problema sanitario importante6; Pertanto, è importante studiare l’impatto di immunosoppressione sul tessuto osseo in grande dettaglio. Negli ultimi anni sono stati sviluppati vari modelli di zebrafish a che fare con la patogenesi di GIO. Perdita dell’osso glucocorticoide-mediata è stata indotta in larve di zebrafish, ad esempio, che ha portato all’identificazione di composti contromisure aumentando la massa di una droga schermo7. Inoltre, gli effetti inibitori dell’osso indotta da glucocorticoidi hanno stati imitati in zebrafish scale sia in vitro che in vivo8,9. Queste analisi sono molto convincenti approcci, soprattutto quando si tratta per l’identificazione di nuovi farmaci immunosoppressivi e osso anabolizzanti. Tuttavia, solo in parte prendono in considerazione l’endoscheletro e non sono stati eseguiti in un contesto rigenerativo. Pertanto, non consentono l’indagine degli effetti glucocorticoide-mediata durante rapida modalità di formazione dell’osso adulto, rigenerativa.
Qui, presentiamo un protocollo che consente ai ricercatori di studiare glucocorticoide-mediata effetti sulle ossa di zebrafish adulto in fase di rigenerazione. Modelli di lesione includono l’amputazione parziale della pinna caudale zebrafish, trapanazione del cranio, così come la creazione delle fratture di pinna ray (Figura 1A-1 C) e sono combinati con glucocorticoidi esposizione tramite incubazione (Figura 1E ). Abbiamo recentemente utilizzato una parte del presente protocollo per descrivere le conseguenze dell’esposizione al prednisolone, uno dei farmaci comunemente prescritti del corticosteroide, il zebrafish adulto rigenerante pinna e cranio osseo10. In zebrafish, gestione di prednisolone porta alla proliferazione degli osteoblasti in diminuzione, differenziazione degli osteoblasti incompleta e rapida induzione dell’apoptosi nel lignaggio del monocito/macrofago10. In questo protocollo, descriviamo anche come fratture possono essere introdotta nella singola aletta ossuta ray segmenti11, come questo approccio può essere utile quando si studia glucocorticoide-mediata effetti sull’osso che si verificano durante la riparazione di frattura. I metodi presentati qui contribuiranno all’ulteriore indirizzo base dei meccanismi di azione glucocorticoide in rapida rigenerazione dell’osso e possono essere impiegati anche in altri contesti sistemica di somministrazione del farmaco nel contesto della rigenerazione dei tessuti di zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish si sono dimostrati utili nella ricerca scheletrico in molti riguardi. Mutanti selezionati imitano gli aspetti della malattia umana come l’osteogenesi imperfetta o osteoartrite23,24,25,26,27, e le larve, come pure le scale vengono utilizzate per identificare composti anabolizzanti osso piccola molecola schermi7,<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del centro di rigenerativa terapie Dresda (“Zebrafish come modello di svelare i meccanismi di perdita dell’osso indotta da glucocorticoidi”) e inoltre da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, progetto 387653785) a FK. Siamo molto grati a Jan Kaslin e Avinash Chekuru per il loro orientamento e assistenza su come eseguire la trapanazione dei calvariae e fratture in raggi della pinna ossuta. Esperimenti sono stati progettati, eseguiti e analizzati da KG e FK. FK ha scritto il manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Katrin Lambert, Nicole Cudak e gli altri membri dei laboratori Knopf e marca per assistenza tecnica e la discussione. Il nostro grazie va anche a Marika Fischer e Jitka Michling per la cura del pesce eccellente e di Henriette Knopf e Josh Currie di correzione il manoscritto per.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
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