نماذج الإصابة الزرد الكبار دراسة آثار البردنيزولون في تجديد أنسجة العظام
Summary
هنا، نحن تصف 3 نماذج الإصابة الزرد الكبار واستخدامها مجتمعة مع العلاج بالعقاقير المثبطة للمناعة. نقدم التوجيه على تصوير لتجديد الأنسجة وكشف تمعدن العظام فيه.
Abstract
الزرد قادرون على تجديد الأجهزة المختلفة، بما في ذلك الملاحق (زعانف) بعد بتر الأطراف. وهذا ينطوي على تجديد العظام، والتي ريجرووس خلال أسبوعين تقريبا بعد الإصابة. وعلاوة على ذلك، الزرد قادرون على شفاء العظام سريعاً بعد تريبانيشن الجمجمة، وإصلاح الكسور التي يمكن إدخالها بسهولة إلى أشعة الزعنفة عظمى الزرد. تمثل هذه فحوصات الإصابة ممكن نماذج تجريبية لاختبار تأثير المخدرات التي تدار على سرعة تشكيل العظام. هنا، نحن تصف استخدام هذه النماذج إصابة 3 واستخدامها مجتمعة مع العلاج جلوكوكورتيكويد المنهجية، التي تمارس الآثار المثبطة وكآبته العظام. نحن توفير سير عمل حول كيفية التحضير للمعالجة المثبطة للمناعة في الزرد الكبار وتوضح كيفية إجراء البتر زعنفة، تريبانيشن كالفاريال العظام والكسور زعنفة، ووصف كيف يؤثر استخدام الكورتيزون كلا تشكيل العظام خلايا الاوستيوبلاستس وخلايا لنسب الوحيدات/بلعم كجزء من الحصانة الفطرية في أنسجة العظام.
Introduction
الزرد تمثل نموذجا حيوان قوية لدراسة التنمية الفقاريات والمرض. وهذا يرجع إلى أن هم الحيوانات الصغيرة التي تتكاثر في شكل جيد للغاية وأن على الجينوم التسلسل الكامل وقابلة للتلاعب1. وتشمل المزايا الأخرى خيار القيام بتصوير العيش المتواصل في مراحل مختلفة، بما في ذلك التصوير في فيفو الزرد الكبار2، والقدرة على أداء شاشات المخدرات عالية الإنتاجية في الزرد اليرقات3. بالإضافة إلى ذلك، الزرد تملك قدرة التجدد عالية في مجموعة متنوعة من الأجهزة والأنسجة بما في ذلك العظام، وهكذا تكون بمثابة نظام مفيد لدراسة أمراض الهيكل العظمى وإصلاح4،5.
مرض ترقق العظام التي يسببها جلوكوكورتيكويد (جيو) الذي ينجم عن العلاج الطويل الأجل مع الكورتيزون، على سبيل المثال أثناء علاج أمراض المناعة الذاتية مثل الربو أو التهاب المفاصل. يطور في حوالي 30% مرضى معاملة جلوكوكورتيكويد جيو ويمثل مشكلة صحية رئيسية6؛ ولذلك، من المهم للتحقق من أثر الكبت المناعي في أنسجة العظام في قدر كبير من التفصيل. وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج الزرد التي تتعامل مع الآلية المرضية لجيو في السنوات الأخيرة. وقد حملت فقدان العظام جلوكوكورتيكويد بوساطة في الزرد اليرقات، على سبيل المثال، مما أدى إلى تحديد هوية المركبات تكييف زيادة كتلة العظام في شاشة المخدرات7. وعلاوة على ذلك، قد تم تحاكي الآثار المثبطة التي يسببها جلوكوكورتيكويد العظام في جداول الزرد في المختبر و في فيفو8،9. هذه الاختبارات مقنعة جداً النهج، ولا سيما عندما يتعلق الأمر بتحديد هوية الرواية العقاقير المنشطة المثبطة للمناعة والعظام. بيد أنها جزئيا فقط تأخذ في الاعتبار اندوسكيليتون وقد لا أجريت في سياق التجدد. وهكذا، أنها لا تتيح تحقيق الآثار بوساطة جلوكوكورتيكويد خلال طرق سريعة لتكوين العظام الكبار، والتجدد.
نقدم هنا، بروتوكول تمكن الباحثين لدراسة آثار جلوكوكورتيكويد بوساطة على عظام الكبار الزرد تمر بالتجدد. نماذج الإصابة تشمل بتر جزئي زعنفة والذيلية الزرد، trepanation الجمجمة، وكذلك إنشاء الكسور رأي زعنفة (الشكل 1Aج-1)، وهي جنبا إلى جنب مع جلوكوكورتيكويد التعرض عن طريق الحضانة (الشكل 1E ). أننا استخدمت مؤخرا جزءا من هذا البروتوكول لوصف النتائج المترتبة على التعرض البردنيزولون، واحد من الأدوية القشرية توصف عادة، على الكبار الزرد تجديد زعنفة والجمجمة العظم10. في الزرد، الإدارة البردنيزولون يؤدي إلى انتشار osteoblast انخفاض، والتمايز osteoblast غير مكتملة والاستقراء السريع للمبرمج في نسب الوحيدات/بلعم10. في هذا البروتوكول، كما يصف لنا كيف يمكن إدخال الكسور في زعنفة عظمى وحيدة رأي قطاعات11، هذا النهج قد تكون مفيدة عند دراسة الآثار بوساطة جلوكوكورتيكويد على العظام التي تحدث أثناء تصليح الكسر. الأساليب المقدمة هنا سيساعد على مواصلة معالجة الأساسية لآليات العمل جلوكوكورتيكويد في سرعة تجديد العظام، ويجوز أيضا في أماكن أخرى من إدارة المخدرات الجهازية في السياق تجديد الأنسجة الزرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أثبتت الزرد مفيدة في الهيكل العظمى للبحث فيما يتعلق بالعديد. طفرات مختارة تحاكي جوانب أمراض البشرية مثل تكون العظم الناقص أو الفصال العظمى23،24،25،،من2627، واليرقات وكذلك جداول تستخدم تحديد المجمعا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذه الدراسة بمنحه مقدمة من مركز “درسدن العلاجات التجدد” (“الزرد كنموذج لكشف آليات فقدان العظام التي يسببها جلوكوكورتيكويد”) وعلاوة على ذلك بمنحه قدرها الأوقيانوغرافية الألمانية (ترانسريجيو 67، المشروع 387653785) للمفتاح الخارجي. ونحن ممتنون جداً كاثلين يان وتشيكورو Avinash للتوجيه والمساعدة على أداء trepanation كالفاريا وكسور في أشعة الزعنفة عظمى. تجارب صممت، وتنفيذها وتحليلها من قبل كجم وكيه. FK كتب المخطوطة. كما نود أن نشكر لامبرت كاترين وكوداك نيكول، وأعضاء آخرين من مختبرات نوف والعلامة التجارية للمساعدة التقنية ومناقشة. كما يذهب شكرنا لماريكا فيشر ويتكا ميتشلينج لرعاية الأسماك الممتازة ونوف هنرييت وكوري جوش لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
References
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
