Взрослый данио рерио травмы модели для изучения последствий преднизолона в регенерации костной ткани
Summary
Здесь мы описываем 3 взрослых рыбок данио травмы модели и их совместное использование с лечение иммуносупрессивным препаратом. Мы предоставляем руководство по визуализации регенерации тканей и на нем обнаружения минерализации костей.
Abstract
Данио рерио способны регенерировать различных органов, включая придатков (плавники) после ампутации. Это включает в себя регенерации кости, которая отрастает в течение примерно двух недель после травмы. Кроме того возможность исцелить костей быстро после трепанации черепа и ремонта трещин, которые могут быть легко введены в костлявые плавник лучи данио рерио данио рерио. Эти анализы травмы представляют собой возможные экспериментальные парадигмы для проверки влияния управляемых наркотиков на быстро формирования кости. Здесь мы описываем, использование этих моделей 3 травмы и их совместное использование с лечения системных глюкокортикоидов, который оказывает тормозящее и иммуносупрессивные эффекты кости. Мы предоставляем рабочего процесса о том, как подготовиться к иммуносупрессивным лечения взрослых рыбок данио, показывают, как выполнять плавник ампутации, трепанация черепа костей и переломы плавник и описывают, как применение глюкокортикоидов влияет на обе кости формирования остеобласты и клетки линии моноцитов/макрофагов частью врожденного иммунитета в костной ткани.
Introduction
Данио рерио представляют собой мощный животных модель для изучения развития позвоночных и болезни. Это связано с тем, что они являются мелких животных, которые размножаются очень хорошо и что их геном полностью виртуализированного и поддаются манипуляции1. Другие преимущества включают возможность выполнения продолжение живых изображений на разных этапах, в том числе в vivo изображений взрослых рыбок данио2, и способности выполнять высокую пропускную способность препарата экраны в zebrafish личинки3. Кроме того данио рерио обладают высокой регенеративной способностью в различных органах и тканях, включая кости и таким образом служат полезной системы для изучения костных болезней и ремонт4,5.
Глюкокортикоидный индуцированного остеопороза (ГИО) является заболевание, которое приводит к от долгосрочного обращения с глюкокортикоидов, например в ходе лечения аутоиммунных заболеваний таких как астма или ревматоидного артрита. GIO в около 30% глюкокортикоидных лечение больных развивается и представляет основных медицинских выпуск6; Таким образом важно исследовать влияние иммуносупрессии на костной ткани в деталях. В последние годы были разработаны различные модели данио рерио, занимающихся патогенеза GIO. Глюкокортикоидный опосредованной костной потери побудило в данио рерио личинки, к примеру, которые привели к выявлению противодействующего соединений увеличения костной массы в наркотиков экран7. Кроме того, тормозящее действие глюкокортикоидов индуцированной кости были передразнил в zebrafish весы как in vitro и in vivo8,9. Эти анализы очень убедительны подходы, особенно когда дело доходит до выявления роман иммуносупрессивных и кости анаболических препаратов. Однако они лишь частично учитывать эндоскелет и не были выполнены в регенеративных контексте. Таким образом они не позволяют расследования глюкокортикоидных опосредованной эффекты во время быстрого режимов формирования взрослых, регенерации костей.
Здесь мы представляем протокол позволяет исследователям изучать глюкокортикоидных опосредованного воздействия на кости взрослых рыбок данио, прохождения регенерации. Травмы модели включают частичная ампутация данио рерио хвостового плавника, трепанация черепа, а также создание плавник Рэй переломов (рис. 1а-1 C) и в сочетании с глюкокортикоидных воздействия через инкубации (Рисунок 1E ). Недавно мы использовали часть настоящего протокола для описания последствий воздействия преднизолона, один из обычно предписываются кортикостероидных препаратов, на взрослых рыбок данио, регенерации костей черепа и плавник10. В данио рерио преднизолон администрация приводит к снижению остеобластов распространения, неполной остеобластов дифференциация и быстрой индукции апоптоза в моноцитов/макрофагов линии10. В этом протоколе мы также описывают как переломы могут быть введены в единый костлявые плавник Рэй сегментов11, как этот подход может оказаться полезным при изучении глюкокортикоидных опосредованного воздействия на кости происходя во время ремонта трещин. Представленные здесь методы поможет дальнейшего решения лежащих в основе механизмов действия глюкокортикоидов в быстро регенерации костной ткани и может также использоваться в других настройках системного лекарствами в контексте данио рерио регенерации тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данио рерио оказались полезными в скелетных исследований во многих отношениях. Выбранный мутантов имитировать аспекты заболеваний человека, таких как несовершенный Остеогенез или остеоартрита23,24,25,26,<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Грант центр восстановительной терапии Дрезден («данио рерио как модель разгадать механизмов глюкокортикоидных индуцированной костной потери») и дополнительно грант Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, проект 387653785) к ФК. Мы очень благодарны Ян Kaslin и Авинаш Chekuru за их руководство и помощь на проведение трепанации calvariae и переломов в костлявые плавник лучи. Эксперименты были разработаны, выполняются и проанализированы кг и FK. FK написал рукопись. Мы также хотели бы поблагодарить Katrin Ламберт, Николь Cudak и другие члены Кнопф и бренд лабораторий для оказания технической помощи и обсуждения. Мы благодарим также Marika Фишер и Иткой Michling для ухода за отличные рыбные и Henriette Knopf и Джош карри для корректуры рукопись.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
References
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
