דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם
Summary
כאן נתאר 3 מודלים פציעה דג זברה מבוגרים, שלהם להשתמש בשילוב עם טיפול תרופות לדיכוי המערכת החיסונית. אנו מספקים הדרכה על הדמיה של התחדשות הרקמות ועל גילוי מינרליזציה עצם המצוי בו.
Abstract
דג זברה מסוגלים להתחדש איברים שונים, כולל תוספות (סנפיר) לאחר קטיעה. פעולה זו כרוכה לרגנרציה של העצם, אשר מתחדש בערך שבועיים לאחר פציעה. יתר על כן, דג זברה מסוגלים לרפא עצם במהירות לאחר trepanation של הגולגולת, ותיקון שברים זה יכול להיות בקלות מוחדרים קרני גרמית סנפיר דג זברה. מבחני פציעה אלה מייצגים פרדיגמות ניסיוני האפשריים כדי לבחון את ההשפעה של תרופות מנוהלת על במהירות ויוצרים העצם. כאן נתאר את השימוש של מודלים אלה פציעה 3 ואת שלהם להשתמש בשילוב עם טיפול מערכתי glucocorticoid, אשר מפעילה עצם מעכבות ואפקטים לדיכוי המערכת החיסונית. אנו מספקים זרימת עבודה כיצד להתכונן לטיפול לדיכוי המערכת החיסונית דג זברה למבוגרים, להמחיש כיצד לבצע קטיעה פין, trepanation של calvarial עצמות, שברים סנפיר, ולתאר כיצד השימוש glucocorticoids משפיעה על שני יוצרי העצם תאי העצם, תאי של שושלת היוחסין מונוציט/מקרופאג כחלק מולדת חסינות רקמת העצם.
Introduction
דג זברה מייצגים במודל בעלי חיים רב עוצמה ללמוד פיתוח חוליות ומחלות. זה בשל העובדה כי הם חיות קטנות זה מתרבים טוב מאוד, כי הגנום שלהם הוא מלא ברצף, לבצע מניפולציה1. יתרונות נוספים כוללים את האפשרות לבצע הדמיה חיה המשך בשלבים שונים, לרבות ויוו הדמיה של דג זברה בוגרת2והיכולת לבצע תפוקה גבוהה סמים מסכי דג זברה הזחלים3. בנוסף, דג זברה בעלי קיבולת גבוהה משובי במגוון של איברים ורקמות כולל העצם, ובכך לשמש מערכת שימושי כדי ללמוד מחלת השלד ותיקון4,5.
אוסטאופורוזיס glucocorticoid-induced (ג’יו) היא מחלה הנובעת טיפול לטווח ארוך עם glucocorticoids, למשל במהלך טיפול מחלות אוטואימוניות כגון אסטמה או דלקת מפרקים שגרונית. ג’יו מתפתח אצל כ- 30% מהחולים שטופלו glucocorticoid ומייצגת בעיה בריאות ור6; לכן, חשוב לחקור את ההשפעה של החיסוני על רקמת העצם בפירוט רב. בשנים האחרונות פותחו מגוון דגמים דג זברה העוסקים בפתוגנזה של ג’יו. איבוד העצם בתיווך glucocorticoid יש כבר המושרה בדג זברה הזחלים, לדוגמה, אשר הובילה הזיהוי של תרכובות counteractive הגדלת מסת העצם אצל סמים מסך7. יתר על כן, עצם המושרה glucocorticoid מעכבות ההשפעות יש כבר חיקה של דג זברה מאזני גם במבחנה וגם ויוו8,9. מבחני אלה הם מאוד משכנע גישות, במיוחד כשמדובר הזיהוי של הרומן סמים אנבוליים לדיכוי המערכת החיסונית ועצמות. עם זאת, הם רק בחלקו לקחת בחשבון את השלד, לא בוצעו בהקשר משובי. לפיכך, הם אינם מאפשרים את חקירת glucocorticoid בתיווך ההשפעות במהלך מהיר מצבים של היווצרות העצם למבוגרים, משובי.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקרים ללמוד glucocorticoid בתיווך ההשפעות על עצמות דג זברה מבוגרים שעברו התחדשות. פציעה מודלים כוללים קטיעה חלקית של סנפיר דג זברה סימטרית, trepanation של הגולגולת, כמו גם היצירה של פין ריי שברים (איור 1Aג-1), בשילוב עם חשיפה הדגירה ויה glucocorticoid (איור 1E ). השתמשנו לאחרונה חלק של פרוטוקול זה כדי לתאר את ההשלכות של חשיפה prednisolone, אחת התרופות הסטרואידים שנקבע בדרך כלל, על דג זברה בוגרת התחדשות העצם סנפיר והגולגולת10. דג זברה, מוביל מינהל prednisolone אוסטאובלסט ירד התפשטות, בידול אוסטאובלסט לא שלם של אינדוקציה מהירה של אפופטוזיס שושלת היוחסין מונוציט/מקרופאג10. ב פרוטוקול זה, גם נתאר כמה שברים יכול להיות מוחדרים יחידה פין גרמית ריי מקטעי11, כמו גישה זו עשויה להיות שימושית כאשר לומדים בתיווך glucocorticoid השפעות על עצם המתרחשים במהלך תיקון שבר. השיטות המובאות כאן יסייע לכתובת נוספות שבבסיס מנגנוני הפעולה glucocorticoid במהירות התחדשות העצם, עשוי גם להיות מועסק בהגדרות אחרות של ניהול סמים מערכתית בהקשר של התחדשות רקמות דג זברה.
Protocol
Representative Results
Discussion
דג זברה הוכיחו מועיל במחקר שלד לגבי רבים. מוטציות שנבחר לחקות היבטים של מחלות אנושיות כגון פרכת או דלקת מפרקים ניוונית23,24,25,26,27, הזחלים, כמו גם סולמות משמשות כדי לזהות העצם תרכובות סטרואידים אנבוליים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק מרכז של משובי טיפולים דרזדן (“דג זברה כמודל לפענח את המנגנונים של אובדן עצם המושרה glucocorticoid”), בנוסף על ידי מענק של פתוח (Transregio 67, פרויקט 387653785) כדי FK. אנחנו מאוד אסירי תודה. Jan Kaslin, Chekuru אווינאש עבור שלהם הדרכה וסיוע על ביצוע trepanation של calvariae, שברים סנפיר גרמית קרני הניסויים היו תוכנן, שבוצעה, נותחו על ידי ק ג, FK. FK כתב היד. כן נרצה להודות Katrin למברט, ניקול Cudak וחברים אחרים של מעבדות קנופף וברנד לקבלת סיוע טכני ודיון. תודתנו גם הולך אל פישר מריקה, Jitka Michling לטיפול דגים מעולה, הנרייטה קנופף, ג’וש קורי להגהת כתב היד.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
References
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Paul, S., Crump, J. G. Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish. Bonekey Reports. 5, 853 (2016).
- Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases. Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).
- den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis. Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- de Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).
- Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale. International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).
- Geurtzen, K., et al. Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues. Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).
- Geurtzen, K., et al. Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull. Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hirasawa, T., Kuratani, S. Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development. Zoological Letters. 1, 2 (2015).
- Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
- Knopf, F., et al. Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin. Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).
- van Eeden, F. J., et al. Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 153-164 (1996).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic & Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
- Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
- Oppedal, D., Goldsmith, M. I. A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Spoorendonk, K. M., et al. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).
- Gioia, R., et al. The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta. Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).
- Fiedler, I. A. K., et al. Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta. Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).
- Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects. Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).
- Hayes, A. J., et al. Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis. PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).
- Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).
- de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay. Bone. 74, 106-113 (2015).
