Modèles de lésion du poisson-zèbre adulte pour étudier les effets de la Prednisolone dans la régénération de tissu osseux
Summary
Nous décrivons ici 3 modèles de lésion de poisson-zèbre adulte et leur utilisation combinée avec un traitement immunosuppresseur. Nous fournissons des conseils sur l’imagerie de la régénération des tissus et sur la détection de la minéralisation des os qui y sont.
Abstract
Poisson zèbre sont capables de régénérer des divers organes, y compris les appendices (nageoires) suite à une amputation. Il s’agit de la régénération des os, ce qui repousse dans environ deux semaines après une blessure. En outre, poisson zèbre sont capables de guérir les os rapidement après trépanation du crâne et réparer les fractures qui peuvent être facilement introduits dans les rayons des nageoires osseuses poisson zèbre. Ces tests de blessures représentent des paradigmes expérimentaux faisables pour tester l’effet des médicaments administrés sur la formation rapide d’os. Nous décrivons ici l’utilisation de ces modèles de 3 lésions et leur utilisation combinée avec un traitement aux glucocorticoïdes systémiques, qui exerce des effets inhibiteurs et immunosuppressives osseuse. Nous fournissons un flux de travail sur la façon de préparer un traitement immunosuppresseur chez le poisson zèbre adulte, montrent comment effectuer la nageoire amputation, trépanation de substance OS et fractures de la nageoire et décrire comment l’utilisation des glucocorticoïdes affecte les deux os formant les ostéoblastes et les cellules de la lignée monocyte/macrophage dans le cadre de l’immunité innée dans le tissu osseux.
Introduction
Poisson zèbre représentent un puissant modèle animal pour étudier la maladie et du développement des vertébrés. Cela est dû au fait qu’ils sont des petits animaux qui se reproduisent très bien et que leur génome est entièrement séquencé et ouvert aux manipulations1. D’autres avantages incluent la possibilité d’effectuer une imagerie live continue à différentes étapes, y compris en vivo imagerie du poisson-zèbre adulte2et la capacité d’exécuter des écrans de drogues à haut débit dans les larves de poisson zèbre3. En outre, poisson zèbre possèdent une grande capacité régénératrice dans une variété d’organes et de tissus, y compris les os et donc constituer un système utile pour étudier les maladies squelettiques et réparer4,5.
L’ostéoporose induite par les glucocorticoïdes (GIO) est une maladie qui résulte d’un traitement à long terme avec des glucocorticoïdes, par exemple dans le cadre du traitement des maladies auto-immunes telles que de l’asthme ou l’arthrite rhumatoïde. GIO se développe chez environ 30 % des patients traités par glucocorticoïdes et représente une édition de santé majeur6; par conséquent, il est important d’étudier l’impact de l’immunosuppression sur tissu osseux dans les moindres détails. Ces dernières années une variété de modèles de poisson-zèbre traitant de la pathogenèse du SCAD ont été développés. La perte osseuse médiée par les glucocorticoïdes a été induite chez les larves de poisson zèbre, par exemple, qui a conduit à l’identification des composés avertissent augmente la masse osseuse chez un médicament écran7. En outre, les effets inhibiteurs osseuse induite par les glucocorticoïdes ont été imités en écailles de poisson-zèbre fois in vitro et in vivo,8,9. Ces tests sont très convaincants des approches, surtout quand il s’agit d’identifier de nouveaux médicaments anabolisants immunosuppresseurs et OS. Cependant, ils seulement partiellement tiennent compte de l’endosquelette et n’ont pas été effectuées dans un contexte régénératrice. Ainsi, ils ne permettent pas l’enquête des effets médiés par les glucocorticoïdes lors des modes rapides de la formation osseuse adulte, régénératrice.
Nous présentons ici un protocole permettant aux chercheurs d’étudier les effets médiés par les glucocorticoïdes sur OS de poisson-zèbre adulte en cours de régénération. Modèles de lésion incluent amputation partielle de la nageoire caudale du poisson-zèbre, trépanation du crâne, ainsi que la création des fractures de ray nageoire (Figure 1 a-1 C) et sont combinés avec des glucocorticoïdes exposition via l’incubation (Figure 1E ). Nous avons récemment utilisé une partie du présent protocole pour décrire les conséquences de l’exposition à la prednisolone, un des médicaments couramment prescrits corticostéroïde, le poisson-zèbre adulte régénérant nageoire et crâne OS10. Chez le poisson zèbre, administration de prednisolone entraîne la prolifération ostéoblastique une diminution, la différenciation ostéoblastique incomplète et rapide induction de l’apoptose dans la lignée de monocytes/macrophages10. Dans le présent protocole, on décrit aussi comment les fractures peuvent être introduits dans seul aileron osseuses ray segments11, que cette approche peut être utile lorsque l’on étudie les effets médiés par les glucocorticoïdes sur l’os qui se produisent au cours de la réparation de la fracture. Les méthodes présentées ici vont aidera à résoudre qui sous-tendent les mécanismes d’action des glucocorticoïdes dans la régénération osseuse de rapidement et peuvent également être employées dans d’autres contextes d’administration systémique de médicaments dans le cadre de la régénération tissulaire de poisson-zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poisson zèbre sont avérés utiles pour la recherche squelettique à bien des égards. Des mutants sélectionnés reproduisent les aspects des maladies humaines telles que l’ostéogenèse imparfaite ou arthrose23,24,25,26,27, et des larves ainsi que des échelles sont utilisées pour identifier les composés anabolisants osseux en petites molécules écrans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par une subvention de la centre de régénérative thérapies Dresde (« poisson-zèbre comme un modèle à élucider les mécanismes de la perte osseuse induite par les glucocorticoïdes ») et, en outre, grâce à une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projet 387653785) au FK. Nous sommes très reconnaissants à Jan Kaslin et Avinash Chekuru pour leurs conseils et leur aide sur l’exécution de trépanation du cranienne et fractures dans les rayons des nageoires osseuses. Des expériences ont été conçus, effectués et analysés par KG et FK. FK a écrit le manuscrit. Nous tenons également à remercier Katrin Lambert, Nicole Cudak et autres membres des laboratoires Knopf et marque pour une assistance technique et de la discussion. Notre gratitude va également Marika Fischer et Jitka Michling pour soins excellents poissons et Henriette Knopf et Josh Currie pour la relecture du manuscrit.
Materials
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3×13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
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