Измерение потребления кислорода печени митохондриальных и Протон утечки кинетики оценить митохондриальное дыхание в Гольштейн молочного скота
Summary
Здесь мы разделяем методы для измерения потребления митохондриальной кислорода, определяющих концепцию питания энергетики и Протон утечки, основной причиной неэффективности в митохондриальной генерации АТФ. Эти результаты можно приходится 30% энергии, потеряли в утилизации питательных веществ, чтобы помочь оценить функции митохондрий.
Abstract
Потребление кислорода, Протон мотив силы (PMF) и Протон утечки являются измерения митохондриальное дыхание, или насколько хорошо митохондрий в состоянии преобразовать NADH и ГВС в СПС. Так как митохондрии также основной сайт для использования кислорода и питательных веществ Окисление диоксида углерода и воды, насколько эффективно они используют кислород и производят АТФ непосредственно относится к эффективности обмена питательных веществ, потребности в питательных веществах животных, и состояние здоровья животного. Этот метод предназначен для изучения митохондриальное дыхание, который может использоваться для изучения воздействия различных препаратов, диеты и воздействия на окружающую среду на митохондриальной метаболизм. Результаты включают потребление кислорода, измеряется как Протон зависит от дыхания (статья 3) и Протон утечки зависит от дыхания (состояние 4). Отношение государства 3 / государственный 4 дыхания определяется как отношение дыхательных путей управления (RCR) и может представлять митохондриальной энергетической эффективности. Митохондриальной Протон утечки является процесс, который позволяет диссипации митохондриальной мембраны потенциальных (СПП) расцеплять окислительного фосфорилирования от ADP, снижается эффективность синтеза АТФ. Кислород и TRMP + чувствительной электроды с митохондриальных субстратов и ингибиторы цепи переноса электронов используются для измерения состояния 3 и 4 государства дыхания, Митохондриальные мембраны PMF (или потенциал для производства АТФ) и Протон утечки. Ограничения этого метода, что ткани печени должны быть как можно более свежей и все биопсии и анализы должны быть выполнены в менее чем 10 h. Это ограничивает количество выборок, которые могут быть собраны и обработаны один человек в день около 5. Однако только в 1 г ткани печени необходима, поэтому в крупных животных, таких как молочного скота, количество образцов необходимо мал по сравнению с печени размер и мало времени восстановления требуется.
Introduction
Митохондрии являются очень чувствительными к стресс и их клеточной среды может способствовать широкий спектр метаболических заболеваний. Протон утечки в митохондриях и потребление кислорода являются показателями здоровья митохондрий. Методы, описанные в этой бумаге смета митохондриальной энергоэффективности с помощью RCR, основанные на потребление кислорода с и без утечки Протон. Эти результаты можно приходится 30% энергии, потеряли в утилизации питательных веществ1. Изменения в утечки Протон и потребления кислорода может идентифицировать митохондриальной дисфункции, которая способствует метаболические болезни и приводит к снижению энергетической эффективности. Эти методы могут также использоваться для изучения влияния различных методов лечения на митохондриальное дыхание. Общая цель измерения потребления митохондриальной кислорода и Протон утечки кинетики — оценить функции митохондрий и энергетической эффективности.
Печеночная митохондриальной дисфункции был связан с несколькими заболеваниями в молочном скотоводстве. Клеточный метаболизм возможность переключения между углеводного и липидного топлива, когда сталкиваются с дефицит энергии в начале кормления зависит от числа и функции митохондрий в ячейки2. Дефекты в митохондриях способность адаптироваться к увеличению спроса на энергию и увеличение β-окисления может привести к накоплению внутриклеточного липидов, связанные с сопротивлением инсулина и может привести к формированию жирной печени в начале кормления дойных коров. Митохондрии, как сайт кетоновые тела производства и использования, могут играть ключевую роль в кетоз в молочных коров3. Отсутствие митохондрий или митохондриальной дисфункции повлияет на доступность топлива к периферии и отражены изменения в потреблении кислорода или RCR.
Изменения потребления в митохондриальной кислорода в ответ на воспаление. 7 день старое бройлеров были случайным образом распределены к группе заражены эймериями Максима и управления группы4. Бройлеров, которые не проходят кокцидиоза вызов имел меньшее потребление кислорода из-за утечки Протон и выше RCR, указывающее, что митохондрий печени реагировать иммунной проблема увеличения Протон утечки. Во время Протон утечки и реактивной видов кислорода считалось признаком митохондриальной мембраны дисфункции и наносит ущерб энергетической эффективности, сейчас известно, что важно для импорта белков и кальция в митохондриях5 и для генерации тепла1.
Электрон утечки из дыхательной цепи делает митохондрий подвержены реактивнооксигенных видов производства и окислительного повреждения митохондриальной мембраны белки, липиды и митохондриальной ДНК. Как возраста митохондрии ущерб может накапливаться, достигая особенно митохондриальной ДНК, вызывая дальнейшее дисфункции в митохондриальной метаболизм6 и большей восприимчивости к болезням коровы. На практике многие скота животных кормят высокого уровня добавки, такие как Cu, Zn и Mn увеличить Антиоксидантная функция. Однако кормления высокий уровень Cu, Zn и Mn сократилось производство молока и увеличение потребления кислорода вследствие Протон утечки (4 состояния дыхания)7.
Предыдущие исследования по вопросу о роли митохондриальной функции в области энергоэффективности в крупного рогатого скота была сосредоточена на изменения в Протон утечки и потребления митохондриальной кислорода. Очень мало исследований были опубликованы в молочном скотоводстве и большинство работ сравнить эффективность производства в виде остаточного потребления корма (RFI) для функции митохондрий в крупного рогатого скота. Изменчивость в митохондриальное дыхание, ставки были рассмотрены путем измерения состояние 3, состояние 4 и RCR в печень из кормящих голштынов и кормящих говядина коровы (Ангус, Брангус и Херефорд)8. Исследователи не нашли каких-либо корреляции в митохондриальное дыхание с роста или доения черты для крупного рогатого скота, но доклад корреляции между митохондриальное дыхание и доения черты для голштины. В двух исследованиях RFI сравнивали в мясном скотоводстве митохондриальное дыхание ставки (состояние 3, состояние 4 и RCR) в мышечных митохондрий9,10. Митохондриальное дыхание ставки изменилась в ответ на DMI и низкие ставки были связаны с менее эффективным говядины Бычков. В другом исследовании RFI Бычков из высоких или низких быков ЗПИ были сопоставлены с митохондриальное дыхание ставки и кинетика утечки протона между двумя группами потомства11. Различия обусловлены получить подтверждающие что делает вывод, что получить не воздействия митохондриальное дыхание в крупного рогатого скота.
В этом документе эксперимент, изучении печени, RCR в ответ на питание 3 антиоксидант минералов для кормящих молочного скота иллюстрирует использование методов измерения потребления кислорода во время 4 и 3 дыхания и PMF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее критической точки в протокол получения образца представитель ткани печени и начало изоляции митохондрий как можно скорее после биопсии. Вариации в измерениях дыхания является низкой (Таблица 1) из-за короткой транспортной время от коровы в лабораторию. Чтобы сократи?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Оллтек и USDA Люк средства через центр здоровья животных пищевой UC Дэвис школа ветеринарной медицины.
Materials
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).
- National Research Council. . Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
