Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein
Summary
Aqui, nós compartilhamos métodos de medição do consumo de oxigênio mitocondrial, um definição conceito de nutricional energética e vazamento de prótons, a principal causa de ineficiência na geração mitocondrial de ATP. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes para ajudar a avaliar a função mitocondrial.
Abstract
Consumo de oxigênio, prótons força (PMF) e vazamento de próton são medidas da respiração mitocondrial, ou quão bem as mitocôndrias são capazes de converter o NADH e DANIII em ATP. Desde que as mitocôndrias são também o local principal para o uso de oxigênio e nutriente oxidação de dióxido de carbono e água, quanto à eficácia, eles usam o oxigênio e produzem ATP diretamente se relaciona com a eficiência do metabolismo de nutrientes, as necessidades de nutrientes do animal, e saúde do animal. A finalidade desse método é examinar a respiração mitocondrial, que pode ser usada para examinar os efeitos das diferentes drogas, dietas e os efeitos ambientais sobre o metabolismo mitocondrial. Os resultados incluem o consumo de oxigênio, medido como respiração dependente de próton (estado 3) e respiração dependente do vazamento próton (estado 4). A relação da respiração estado 4 3 / estado é definida como índice de controlo respiratório (ICR) e pode representar a eficiência energética mitocondrial. Vazamento de próton mitocondrial é um processo que permite a dissipação do potencial de membrana mitocondrial (MMP) desacoplamento fosforilação oxidativa do ADP, diminuindo a eficiência da síntese de ATP. Oxigênio e TRMP + eletrodos sensíveis com substratos mitocondriais e inibidores da cadeia de transporte de elétrons são usados para medir o estado 3 e 4 do estado respiração, membrana mitocondrial PMF (ou o potencial para produzir ATP) e vazamento de próton. Limitações para este método são que o tecido do fígado deve ser tão fresco quanto possível e todas as biópsias e ensaios devem ser realizados em menos de 10 h. Isso limita o número de amostras que podem ser recolhidos e tratados por uma única pessoa de um dia para aproximadamente 5. No entanto, é necessário apenas 1 g de tecido hepático, então em grandes animais, como gado leiteiro, a quantidade de amostra necessária é pequena em relação ao tamanho do fígado e há pouco tempo de recuperação necessário.
Introduction
As mitocôndrias são muito sensíveis ao estresse e seu ambiente celular pode contribuir para uma ampla variedade de doenças metabólicas. Consumo de oxigênio e vazamento de prótons na mitocôndria são indicadores de saúde de mitocôndrias. Os métodos descritos neste papel estimativa mitocondrial eficiência de energia usando RCR baseiam no consumo de oxigênio, com e sem vazamento de próton. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes1. Mudanças no consumo e próton vazamento de oxigênio podem identificar a disfunção mitocondrial, o que contribui para doenças metabólicas e resulta em eficiência energética diminuída. Esses métodos também podem ser usados para examinar o efeito de diferentes tratamentos na respiração mitocondrial. O objectivo geral de medição de consumo de oxigênio mitocondrial e cinética de vazamento de próton é para avaliar a função mitocondrial e eficiência energética.
Disfunção mitocondrial hepática tem sido associada com várias doenças no gado leiteiro. A capacidade do metabolismo celular para alternar entre combustíveis carboidrato e lipídios quando confrontados com um déficit de energia no início da lactação é influenciada pelo número e função da mitocôndria na célula2. Defeitos na capacidade das mitocôndrias de adaptar-se a um aumento da demanda de energia e aumento da β-oxidação podem levar ao acúmulo de lipídios intracelulares associados com resistência à insulina e podem levar à formação de esteatose hepática em vacas leiteiras de início da lactação. Mitocôndrias, como local de produção do corpo de cetona e uso, podem desempenhar um papel chave em cetose em vacas leiteiras3. Falta de mitocôndrias ou disfunção mitocondrial afetará a disponibilidade de combustível para a periferia e reflectir-se em mudanças no consumo de oxigênio ou RCR.
Alterações de consumo de oxigênio mitocondrial em resposta à inflamação. Sete dias de idade frangos foram aleatoriamente a um grupo de infectados com maxima de Eimeria e um grupo de controle4. Frangos de corte que não sofreu desafio de coccidiose tinham menor consumo de oxigênio devido ao vazamento de próton e RCR superior indicando que mitocôndrias hepáticas respondem a um desafio imune por crescente fuga de próton. Durante a fuga de próton e reativa produção de espécies de oxigênio foi considerada um sinal de disfunção da membrana mitocondrial e prejudicial para a eficiência energética, agora sabe-se que é importante para a importação de proteínas e cálcio em mitocôndrias5 e para a geração de calor1.
Vazamento de elétrons da cadeia respiratória faz mitocôndrias suscetíveis à produção de espécies reativas de oxigênio e danos oxidativos às proteínas da membrana mitocondrial, lipídios e DNA mitocondrial. Como idade de mitocôndrias, dano pode acumular-se especialmente ao DNA mitocondrial, causando mais de disfunção no metabolismo mitocondrial6 e maior suscetibilidade da vaca a doença. Na prática, muitos animais de pecuária são alimentados com altos níveis de suplementos tais como Cu, Zn e Mn para impulsionar a função antioxidante. No entanto, alimentando a altos níveis de Cu, Zn e Mn diminuição da produção de leite e aumentaram do consumo de oxigênio devido a próton vazamento (respiração estado 4)7.
Pesquisas anteriores sobre o papel da função mitocondrial em eficiência energética em gado centrou-se sobre as mudanças no consumo de oxigênio mitocondrial e vazamento de próton. Poucos estudos foram publicados no gado leiteiro e a maioria dos jornais comparam a eficiência de produção sob a forma de consumo de ração residual (RFI) para a função mitocondrial em bovinos de corte. Variabilidade na respiração mitocondrial taxas foram examinadas através da medição o estado 3, estado 4 e RCR em fígados de carne de vaca em lactação e vacas em lactação de Holstein vacas (Angus, Brangus e Hereford)8. Os pesquisadores não encontrou qualquer correlação na respiração mitocondrial com crescimento ou ordenha traços dos bovinos, mas fizeram relatório uma correlação entre a respiração mitocondrial e traços para Holsteins de ordenha. Em dois estudos, RFI foi comparado em bovinos de corte para taxas de respiração mitocondrial (estado 3, estado 4 e RCR) no músculo mitocôndrias9,10. Taxas de respiração mitocondrial alterada em resposta a DMI e taxas baixas foram associadas com novilhos de carne menos eficientes. Em outro estudo, RFI de novilhos de touros de alta ou baixos RFI foram comparados com as taxas de respiração mitocondrial e cinética de vazamento de protões entre os dois grupos de descendência11. As diferenças foram devido ao ganho confirmando a conclusão de que a ganhar faz não respiração mitocondrial impacto em bovinos de corte.
Neste trabalho, um experimento para examinar o fígado RCR em resposta à alimentação 3 minerais antioxidante para gado de leite em lactação ilustra o uso de métodos para medir consumo de oxigênio durante 4 do estado e estado 3 respiração e PMF.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ponto mais crítico no protocolo é obter uma amostra representativa de tecido hepático e começando o isolamento da mitocôndria, logo que possível após a biópsia. Variação nas medições de respiração é baixa (tabela 1) devido a um tempo de transporte curto de vaca para laboratório. Para reduzir o tempo de transporte, foi instituído um pequeno laboratório no escritório da leiteria, e amostras de fígado foram levadas para o laboratório de escritório como cada uma foi coletada para que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela Alltech e USDA Hatch fundos através do centro de Sanidade Animal de comida na UC Davis School de medicina veterinária.
Materials
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
References
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