Misurazione del consumo dell'ossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte Holstein
Summary
Qui, si condividono i metodi di misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale, un concetto di definizione di energetica nutrizionale e perdita di protone, la causa primaria di inefficienza nella generazione mitocondriale di ATP. Questi risultati possono rappresentare 30% di energia perdita nell’utilizzazione dei nutrienti per aiutare a valutare la funzione mitocondriale.
Abstract
Consumo di ossigeno, (PMF) della forza motrice protonica e perdita del protone sono misurazioni di respirazione mitocondriale, o quanto bene i mitocondri sono in grado di convertire NADH e FADH in ATP. Poiché i mitocondri sono anche il luogo primario per l’uso di ossigeno e nutrienti ossidazione ad anidride carbonica e acqua, quanto efficientemente usano ossigeno e produrre ATP direttamente riguarda l’efficienza del metabolismo dei nutrienti, esigenze nutrizionali dell’animale, e salute dell’animale. Lo scopo di questo metodo è quello di esaminare la respirazione mitocondriale, che può essere utilizzata per esaminare gli effetti di diversi farmaci, le diete e gli effetti ambientali sul metabolismo mitocondriale. I risultati includono consumo di ossigeno misurato come respirazione dipendente protone (stato 3) e protone perdita dipendente respirazione (stato 4). Il rapporto della respirazione 4 3 / stato stato è definito come rapporto di controllo respiratorio (RCR) e può rappresentare l’efficienza energetica mitocondriale. Perdita di mitocondriale del protone è un processo che permette la dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP) da disgiungere fosforilazione ossidativa da ADP diminuendo l’efficienza della sintesi di ATP. Ossigeno e TRMP + elettrodi sensibili con substrati mitocondriali e inibitori della catena di trasporto degli elettroni sono utilizzati per misurare State 3 e 4 di stato respirazione, membrana mitocondriale PMF (o il potenziale di produrre l’ATP) e perdita del protone. Limitazioni a questo metodo sono che il tessuto del fegato deve essere più fresco possibile e tutte le biopsie e le analisi devono essere eseguite in meno di 10 ore. Questo limita il numero di campioni che possono essere raccolti ed elaborati da una sola persona in un giorno per circa 5. Tuttavia, è necessario solo 1 g di tessuto del fegato, quindi in grandi animali, come bovini da latte, la quantità di campione necessaria è piccola rispetto alle dimensioni del fegato e c’è poco tempo di recupero necessario.
Introduction
I mitocondri sono molto sensibili allo stress e loro ambiente cellulare può contribuire a una vasta gamma di malattie metaboliche. Consumo di ossigeno e perdita di protoni in mitocondri sono indicatori della salute di mitocondri. I metodi descritti in questa efficienza energetica mitocondriale di carta stima utilizzando RCR basano sul consumo di ossigeno con e senza perdita di protoni. Questi risultati possono rappresentare 30% dell’energia perdita in utilizzazione nutriente1. Cambiamenti nella perdita del protone e consumo di ossigeno possono identificare la disfunzione mitocondriale che contribuisce alla malattia metabolica e si traduce in una riduzione dell’efficienza energetica. Questi metodi possono essere utilizzati anche per esaminare l’effetto di trattamenti diversi su respirazione mitocondriale. L’obiettivo generale di misurare il consumo di ossigeno mitocondriale e cinetica di perdita del protone è di valutare la funzione mitocondriale ed efficienza energetica.
Disfunzione mitocondriale epatica è stata associata con parecchie malattie nei bovini da latte. La capacità del metabolismo cellulare per passare tra combustibili del carboidrato e del lipido di fronte a un deficit energetico in lattazione iniziale è influenzata dal numero e dalla funzione dei mitocondri in cellule2. Difetti nella capacità di adattarsi a un aumento della domanda di energia e β-ossidazione aumentata dei mitocondri possono portare ad accumulo di lipidi intracellulari associati con insulino-resistenza e possono portare alla formazione di fegato grasso nelle vacche da latte di inizio lattazione. I mitocondri, come il sito di produzione di corpi chetonici e l’uso, possono giocare un ruolo chiave in chetosi nelle vacche da latte3. Una mancanza di mitocondri o disfunzione mitocondriale urterà la disponibilità di carburante alla periferia e rifletteva in variazioni di consumo di ossigeno o RCR.
Modifiche di consumo di ossigeno mitocondriale in risposta ad infiammazione. Sette-giorno-vecchio polli da carne sono stati assegnati a un gruppo infettato da Eimeria maxima e un gruppo di controllo4. Polli da carne che non subissero sfida coccidiosi aveva più basso consumo di ossigeno a causa di perdita di protone e RCR superiore che indica che i mitocondri del fegato rispondano ad una sfida immune da crescente perdita di protoni. Durante la perdita di protone e reattiva produzione di specie di ossigeno una volta era considerata un segno di disfunzione mitocondriale della membrana e dannosa per l’efficienza energetica, ora è conosciuto che è importante per l’importazione di proteine e di calcio in mitocondri5 e per la generazione di calore1.
Perdita di elettroni dalla catena respiratoria rende i mitocondri suscettibile di produzione di specie reattive dell’ossigeno ed il danno ossidativo alle proteine della membrana mitocondriale, lipidi e DNA mitocondriale. Come età di mitocondri, danno può accumularsi soprattutto al mtDNA causando ulteriore disfunzione nel metabolismo mitocondriale6 e una maggiore suscettibilità della mucca alla malattia. In pratica, molti animali da allevamento sono alimentati alti livelli di integratori come Cu, Zn e Mn per amplificare la funzione antiossidante. Tuttavia, d’alimentazione alti livelli di Cu, Zn e Mn diminuita produzione di latte e aumento del consumo di ossigeno a causa di protone perdita (stato 4 respirazione)7.
Precedenti ricerche sul ruolo della funzione mitocondriale dell’efficienza energetica nei bovini è focalizzata sui cambiamenti nel consumo di ossigeno mitocondriale e perdita di protoni. Molto pochi studi sono stati pubblicati nei bovini da latte e la maggior parte delle carte confrontare l’efficienza di produzione sotto forma di assunzione di mangime residuo (RFI) per la funzione mitocondriale in bovini da carne. Variabilità nella respirazione mitocondriale tariffe sono state esaminate misurando stato 3 4 e RCR in fegati da vacche Holstein in lattazione e allattamento manzo mucche (Angus, Hereford and Brangus)8. I ricercatori non hanno trovato alcuna correlazione nella respirazione mitocondriale con crescita o mungitura tratti per bovini da carne, ma hanno dato una correlazione tra la respirazione mitocondriale e tratti per Holsteins di mungitura. In due studi, RFI è stato confrontato in bovini da carne a tasso di respirazione mitocondriale (stato 3, stato 4 e RCR) nel muscolo mitocondri9,10. Tassi di respirazione mitocondriale ha cambiato in risposta a DMI e tassi bassi sono stati associati con meno efficiente manzo manzi. In un altro studio, RFI di manzi da tori RFI alte o basse sono stati confrontati con i tassi di respirazione mitocondriale e cinetica di perdita del protone fra i due gruppi di progenie11. Le differenze erano dovuto guadagno conferma la conclusione che guadagno fa non respirazione mitocondriale di impatto nei bovini da carne.
In questa carta, un esperimento esame fegato RCR in risposta all’alimentazione 3 minerali antiossidanti per bovini da latte durante l’allattamento viene illustrato l’utilizzo di metodi per misurare il consumo di ossigeno durante stato 4 e stato 3 PMF e respirazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il punto più critico nel protocollo è ottenere un campione rappresentativo del tessuto del fegato e cominciando l’isolamento dei mitocondri più presto possibile dopo la biopsia. Variazione nelle misurazioni di respirazione è bassa (tabella 1) a causa di un tempo breve trasporto dalla mucca al laboratorio. Per ridurre i tempi di trasporto, un piccolo laboratorio è stato istituito presso l’ufficio del caseificio, e campioni di fegato sono stati guidati al laboratorio ufficio come ciascuno è stato rac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dai fondi Alltech e USDA Hatch attraverso il centro per la salute di cibo animale presso UC Davis School of Veterinary Medicine.
Materials
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
References
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