ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク動態測定
Summary
ここで、ミトコンドリアの酸素消費量、栄養エネルギー論とプロトンのリーク、ミトコンドリア ATP 生成の非効率性の主な原因の定義する概念を測定するための方法を共有します。これらの結果は、ミトコンドリアの機能を評価するのに役立つ栄養の使用率で失われるエネルギーの 30% は考慮できます。
Abstract
酸素消費量、プロトン動機力 (PMF)、プロトン リークはミトコンドリア呼吸やミトコンドリアが NADH や FADH を ATP に変換することができるどれだけの測定です。どのように効率的に彼らは酸素を使用し、直接 ATP を生成を栄養代謝の効率に関連しているミトコンドリアは酸素使用と二酸化炭素と水に栄養素の酸化のためのプライマリ サイトではまたので、動物の栄養要求と動物の健康。このメソッドの目的は、さまざまな薬物、食事や環境に及ぼすミトコンドリア代謝の効果を検討するためミトコンドリアの呼吸を調べることです。結果には、プロトン依存呼吸 (状態 3) とプロトン リーク依存呼吸 (状態 4) 測定酸素消費が含まれます。状態 3/状態 4 呼吸の比率は呼吸調節比 (RCR) として定義され、ミトコンドリアのエネルギー効率を表すことができます。ミトコンドリアのプロトン リークは、ADP を ATP 合成の効率が下がりますから酸化リン酸化の脱共役のミトコンドリア膜電位 (MMP) の損失をできるようにするプロセスです。状態 3 状態 4 呼吸、ミトコンドリア膜 PMF や ATP を作り出す潜在性) を測定する使用されるミトコンドリアの基板と電子輸送鎖阻害剤酸素と TRMP + 敏感電極とプロトンのリーク。このメソッドの制限、肝組織は可能な限り新鮮なする必要があります、すべての生検とアッセイは、10 h 未満で行う必要があります。これは、サンプルを収集し、約 5 日で一人で処理できる数を制限します。ただし、乳用牛などの大型動物に必要なサンプル量は肝臓の大きさに比べて小さい、少しの回復時間が必要なので、肝組織の 1 g だけが必要です。
Introduction
ミトコンドリアはストレスに非常に敏感、彼らの携帯電話の環境は様々 な代謝疾患に貢献できます。酸素消費量とミトコンドリアのプロトン リークがミトコンドリア健康の指標です。RCR を使用してこの用紙見積もりのミトコンドリアのエネルギー効率で説明する方法は、酸素消費量とプロトン リークせずに基づいています。これらの結果は、栄養使用率1で失われたエネルギーの 30% は考慮できます。酸素消費量とプロトン リークの変化はミトコンドリア代謝性疾患に貢献し、減らされたエネルギー効率の結果を識別できます。これらのメソッドは、ミトコンドリア呼吸にさまざまな治療法の効果を検討するも使用できます。ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク カイネティクス測定の全体的な目標は、ミトコンドリアの機能とエネルギー効率を評価するためには。
肝ミトコンドリア機能不全は、乳牛のいくつかの疾患に関連付けられています。泌乳初期にエネルギー収支の赤字に直面して炭水化物や脂質の燃料を切り替えるに細胞の代謝能力は、数と2細胞内のミトコンドリアの機能によって影響されます。ミトコンドリアのエネルギーと増加する β-酸化の需要の増加に適応能力の欠陥はインスリン抵抗性に関連する細胞内の脂質の蓄積につながることができ、泌乳牛の泌乳初期の脂肪肝の形成につながる可能性があります。ミトコンドリア、ケトン体の生産と利用、サイトとして、乳牛3でケトーシスで重要な役割を再生できます。ミトコンドリアやミトコンドリア機能障害の欠如は周囲に燃料の可用性に影響を与えるし、酸素消費量または RCR の変更に反映されます。
炎症応答のミトコンドリアの酸素消費変化。7 日齢のブロイラーは、アイメリア ・ マキシマとコントロール グループ4感染グループにランダムに割り当てられました。コクシジウム症の挑戦を受けていないブロイラーは、プロトン リークと肝ミトコンドリアが増加陽子リークによって免疫チャレンジに応答を示す高い RCR のため低酸素消費を持っていた。プロトン リークしながら反応酸素種の生産は一度ミトコンドリア膜機能不全の兆候とエネルギー効率に支障をきたす、今知られているミトコンドリア5にタンパク質とカルシウムのインポートすることが重要です。、および熱1の生成のため。
呼吸鎖の電子漏れはミトコンドリアの膜蛋白質、脂質およびミトコンドリア DNA ミトコンドリアが活性酸素種の生産と酸化的損傷を受けやすいになります。ミトコンドリアの年齢としてダメージが蓄積されミトコンドリア ミトコンドリア代謝6や牛の病気への感受性を増加でさらに機能不全を引き起こしている、特に。実際には、多くの家畜動物は、高レベルの抗酸化機能を高めるため Cu, Zn, Mn などのサプリメントを供給されています。ただし、Cu の高レベルを供給、Zn, Mn 牛乳生産の減少、プロトン リーク (状態 4 呼吸)7のための酸素消費量を増加します。
牛のエネルギー効率におけるミトコンドリア機能の役割に関する先行研究は、ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リークの変化を重視しています。非常にいくつかの研究は、乳牛で公開されているし、ほとんどの論文は肉用牛におけるミトコンドリア機能に残留飼料摂取量 (RFI) の形で生産効率を比較します。ホルスタイン雌牛から授乳中の牛の肝臓状態 3、4 および RCR を測定することによって料金を調べたミトコンドリア呼吸の変動は牛 (アンガス、ヘレフォード Brangus)8.研究者は、ミトコンドリア呼吸成長や搾乳のための肉用牛の特徴の相関関係を見つけなかったが、ミトコンドリア呼吸と搾乳ホルスタインの特徴間の相関関係を報告でした。2 つの研究の RFI がミトコンドリア呼吸速度 (3、4 の状態と RCR の状態) に肉用牛筋ミトコンドリア9,10で比較されました。ミトコンドリア呼吸速度変更 dmi 対応と低料金が少ない効率的な肥育に関連付けられていた。別の研究で高または低の RFI ブルズから去勢牛の RFI はミトコンドリア呼吸速度とプロトン リーク カイネティクス子孫11の 2 つのグループ間で比較しました。違いは、利得を得る結論は肉用牛では、ミトコンドリア呼吸を影響を確認するためだった。
本稿で RCR 泌乳牛に 3 の抗酸化ミネラルを餌に応答を測定する方法の使用に示します肝臓を調べる実験中に酸素消費量 4 の状態し、3 の呼吸と PMF の状態します。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルの最も重要な点は代表的な肝組織サンプルを取得し、生検後できるだけ早くミトコンドリアの分離を開始します。呼吸測定の変化は低所に牛から短い輸送時間のため (表 1)。輸送時間を減らすためには、小さな実験室を設置、酪農場の事務所で、ミトコンドリアが生検の 10 分内に分離されるので、各収集された、肝臓サンプルが事務所に追い込まれました。セットア?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、食品動物健康 UC デービス校獣医学校の中心を通ってアルテックと米国農務省のハッチの資金によって支えられました。
Materials
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
References
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