Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee
Summary
We delen hier, methoden voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik, een bepalende concept van nutritionele energetics en proton lek, de primaire oorzaak van inefficiëntie in mitochondriale generatie van ATP. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik om te helpen evalueren van mitochondriale functie.
Abstract
Zuurstofverbruik proton motive force (PMF) en proton lek zijn metingen van de mitochondriale ademhaling, of hoe goed de mitochondriën zijn kundig voor bekeerling NADH en FADH in ATP. Aangezien mitochondriën ook de primaire site voor zuurstof gebruik en nutriënten oxidatie in kooldioxide en water zijn, hoe efficiënt ze zuurstof gebruiken en produceren van ATP rechtstreeks betrekking heeft op de efficiëntie van nutriënten metabolisme, voedingsstoffen eisen van het dier, en gezondheid van het dier. Het doel van deze methode is te onderzoeken van mitochondriale ademhaling, die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de gevolgen van verschillende drugs, diëten en milieueffecten op mitochondriale metabolisme. Resultaten omvatten zuurstofverbruik gemeten als proton afhankelijke ademhaling (staat 3) en proton lek afhankelijke ademhaling (staat 4). De verhouding tussen staat 3 / staat 4 ademhaling wordt gedefinieerd als respiratoire controle verhouding (RCR) en mitochondriale energetische efficiëntie kan vertegenwoordigen. Mitochondriale proton lek is een proces waarmee dissipatie van Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) door ontkoppelingseiwit oxidatieve fosforylatie van ADP minderen van de efficiëntie van de ATP-synthese. Zuurstof en TRMP + gevoelige elektroden met mitochondriale substraten en elektronentransport keten remmers worden gebruikt als eenheid staat 3 en staat 4 ademhaling, mitochondriale membraan PMF (of het potentieel voor de productie van ATP) en proton lek. Beperkingen van deze methode zijn dat leverweefsel zo vers mogelijk moet en alle biopsies en tests moeten worden uitgevoerd in minder dan 10 h. Dit beperkt het aantal monsters dat kan worden verzameld en verwerkt door één persoon in een dag om ongeveer 5. Echter, slechts 1 g van leverweefsel nodig is, dus in grote dieren, zoals melkvee, de hoeveelheid monster nodig klein ten opzichte van de grootte van de lever is en er weinig hersteltijd nodig is.
Introduction
Mitochondriën zijn zeer gevoelig voor stress en hun cellulaire omgeving kan bijdragen tot een breed scala aan metabole ziekten. Zuurstofverbruik en proton lek in mitochondriën zijn indicatoren voor de gezondheid van de mitochondriën. De methoden die worden beschreven in dit papier schatting mitochondriale energie-efficiëntie met behulp van RCR gebaseerd op zuurstofverbruik met en zonder proton lek. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik1. Wijzigingen in zuurstof verbruik en proton lek herkent mitochondriale dysfunctie die bijdraagt tot metabole ziekte en resulteert in verminderde energie-efficiëntie. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om te onderzoeken van het effect van verschillende behandelingen op mitochondriale ademhaling. Het algemene doel van het meten van mitochondriale zuurstofverbruik en proton lek kinetiek is mitochondriale functie en energetische doeltreffendheid te beoordelen.
Hepatische mitochondriale dysfunctie is gekoppeld aan verschillende ziekten in melkvee. Het vermogen van cellulaire metabolisme om te schakelen tussen koolhydraten en lipide brandstoffen wanneer zij worden geconfronteerd met een energie tekort in begin lactatie wordt beïnvloed door het aantal en de functie van de mitochondriën in de cel2. Defecten in het vermogen van de mitochondriën aan te passen aan een grotere vraag naar energie en hogere β-oxidatie kunnen leiden tot ophoping van intracellulaire lipide geassocieerd met insulineresistentie en kunnen leiden tot de vorming van vette lever in begin lactatie melkkoeien. Mitochondriën, kunnen als de site van keton lichaam productie en gebruik, een belangrijke rol in ketose in melkkoeien3. Een gebrek van de mitochondriën of mitochondriale dysfunctie zal gevolgen hebben voor de beschikbaarheid van de brandstof naar de periferie en worden weerspiegeld in veranderingen in zuurstofverbruik of RCR.
Mitochondriale zuurstof verbruik verandert in reactie op ontsteking. Zeven-dag-oude vleeskuikens werden willekeurig toegewezen aan een groep geïnfecteerd met Eimeria maxima en een controle groep4. Vleeskuikens die coccidiosis uitdaging niet ondergaan had lager zuurstofverbruik als gevolg van proton lek en hogere RCR die aangeeft dat de lever-mitochondria op een immuun uitdaging door toenemende proton lek reageren. Terwijl het proton lek en reactieve zuurstof soorten productie werd ooit beschouwd als een teken van mitochondriale membraan dysfunctie en ten koste van energetische efficiëntie, nu het is bekend dat het belangrijk is voor de invoer van proteïnen en calcium in mitochondriën5 , en voor de opwekking van warmte1.
Elektron lek uit de luchtwegen keten maakt mitochondriën vatbaar voor reactieve zuurstof soorten productie en oxidatieve schade aan mitochondriale membraaneiwitten, lipiden en mitochondriaal DNA. Als mitochondriën leeftijd, schade kan accumuleren vooral aan mtDNA, waardoor verdere dysfunctie in mitochondriale metabolisme6 en grotere gevoeligheid van de koe voor ziekte. In de praktijk worden veel dieren dieren hoge niveaus van supplementen zoals Cu, Zn en Mn te stimuleren anti-oxidant functie gevoed. Echter voeding van hoge niveaus van Cu, Zn en Mn daalde de melkproductie en toegenomen zuurstofverbruik als gevolg van proton lek (staat 4 ademhaling)7.
Eerder onderzoek over de rol van mitochondriale functie in energie-efficiëntie bij runderen heeft gericht op veranderingen in de mitochondriale zuurstofverbruik en proton lek. Weinig studies zijn gepubliceerd in melkvee en de meeste papieren vergelijk productie-efficiëntie in de vorm van residuele voeropname (RFI) aan mitochondriale functie in runderen. Variabiliteit in mitochondriale ademhaling tarieven werden onderzocht door het meten van toestand 3, staat 4 en RCR in levers van zowel zogende Holstein koeien en rundvlees zogende koeien (Angus, Brangus en Hereford)8. De onderzoekers did niet vondst ieder correlatie in mitochondriale ademhaling met groei of eigenschappen voor runderen melken maar een correlatie tussen mitochondriale ademhaling en melken eigenschappen voor Holsteins verslag. In twee studies, bedroeg RFI vergeleken in rundvlees vee naar mitochondriale ademhaling tarieven (staat 3, staat 4 en RCR) in spier mitochondriën9,10. Mitochondriale ademhaling tarieven gewijzigd in reactie op DMI en lage tarieven werden geassocieerd met minder efficiënt rundvlees ossen. In een andere studie, RFI van ossen uit de hoge of lage RFI stieren werden vergeleken met de tarieven van mitochondrial ademhaling en proton lek kinetiek tussen de twee groepen van nakomelingen11. Verschillen waren te wijten aan winst bevestigen de conclusie dat krijgen doet niet effect mitochondriale ademhaling in runderen.
In deze paper, een experiment dat onderzoekt lever RCR in reactie op het vervoederen van 3 antioxidant mineralen aan zogende melkvee het gebruik van methoden illustreert voor het meten van zuurstofverbruik tijdens staat 4 en staat 3 ademhaling en PMF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het meest kritieke punt in het protocol is het verkrijgen van een steekproef representatief leverweefsel en beginnen het isolement van de mitochondriën zo spoedig mogelijk na biopsie. Variatie in ademhaling metingen is laag (tabel 1) als gevolg van een korte transporttijd van koe naar laboratorium. Verklein de transporttijd en een klein laboratorium opgericht in het kantoor van de melkerij, en lever monsters naar het laboratorium van office werden verdreven, zoals elk werd verzameld zodat mitochondriën…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door Alltech en USDA Hatch fondsen door het centrum voor levensmiddelen, diergezondheid bij UC Davis School voor diergeneeskunde.
Materials
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
References
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).
- National Research Council. . Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759 (2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
