Medir consumo de oxígeno mitocondrial hepática y la cinética de pérdida de protón para estimar la respiración mitocondrial en el ganado de lechero Holstein
Summary
Aquí, compartimos los métodos para medir el consumo de oxígeno mitocondrial, un concepto definitorio de nutrición energética y escape de protones, la principal causa de ineficiencia en generación mitocondrial de ATP. 30% de la energía perdida en la utilización de nutrientes para ayudar a evaluar la función mitocondrial pueden explicar estos resultados.
Abstract
Consumo de oxígeno, fuerza de motivo del protón (PMF) y fuga de protones son las medidas de la respiración mitocondrial, o bien las mitocondrias son capaces de convertir los NADH y FADH en ATP. Puesto que las mitocondrias son el sitio primario para el uso de oxígeno y nutrientes oxidación a dióxido de carbono y agua, sobre la eficacia que utilizan oxígeno y producen ATP directamente se relaciona con la eficiencia del metabolismo de nutrientes, necesidades de nutrientes del animal, y salud del animal. El propósito de este método es examinar la respiración mitocondrial, que puede utilizarse para examinar los efectos de diferentes fármacos, dietas y efectos ambientales sobre el metabolismo mitocondrial. Los resultados incluyen el consumo de oxígeno medido como respiración dependiente de protones (estado 3) y respiración dependiente de fuga de protones (estado 4). La relación de la respiración del estado 3 / Estado 4 se define como el cociente del control respiratorio (RCR) y puede representar eficiencia energética mitocondrial. Escape de protones mitocondrial es un proceso que permite la disipación del potencial de membrana mitocondrial (MMP) por desacoplar la fosforilación oxidativa de ADP disminuye la eficiencia de síntesis de ATP. Oxígeno y TRMP + electrodos sensibles con sustratos mitocondriales e inhibidores de la cadena de transporte de electrones se utilizan para medir el estado 3 y estado 4 respiración, membrana mitocondrial PMF (o el potencial para producir ATP) y fuga de protones. Limitaciones a este método son que el tejido del hígado debe ser tan fresco como sea posible y todas las biopsias y los análisis deben realizarse en menos de 10 h. Esto limita el número de muestras que pueden ser recogidos y procesados por una sola persona en un día a unos 5. Sin embargo, es necesario sólo 1 g de tejido hepático, por lo que en grandes animales, como vacas lecheras, la cantidad de muestra necesaria es pequeña en relación con el tamaño del hígado y hay poco tiempo de recuperación necesario.
Introduction
Las mitocondrias son muy sensibles al estrés y su entorno celular puede contribuir a una amplia variedad de enfermedades metabólicas. Consumo de oxígeno y escape de protones en la mitocondria son indicadores de la salud de las mitocondrias. Los métodos descritos en este documento estimación mitocondrial eficiencia usando RCR basan en el consumo de oxígeno con y sin fuga de protones. Estos resultados pueden representan 30% de la energía perdida en la utilización de nutrientes1. Cambios en la fuga de oxígeno consumo y protón pueden identificar la disfunción mitocondrial que contribuye a la enfermedad metabólica y resultados en eficiencia energética disminuida. Estos métodos pueden utilizarse también para examinar el efecto de diferentes tratamientos sobre la respiración mitocondrial. El objetivo de medir consumo de oxígeno mitocondrial y la cinética de pérdida de protón es evaluar la función mitocondrial y la eficiencia energética.
Disfunción mitocondrial hepática se ha asociado con varias enfermedades en el ganado lechero. La capacidad de metabolismo celular para cambiar entre los combustibles hidratos de carbono y lípidos frente a un déficit de energía en la lactancia temprana está influenciada por el número y función de mitocondrias en la célula2. Defectos en la capacidad de adaptarse a una mayor demanda de energía y aumento de la β-oxidación de las mitocondrias pueden conducir a la acumulación de lípidos intracelulares asociados con resistencia a la insulina y pueden conducir a la formación de hígado graso en vacas primera lactancia. Las mitocondrias, como el sitio de producción del cuerpo de la cetona y el uso, pueden jugar un papel clave en cetosis en vacas lecheras3. La falta de mitocondrias o disfunción mitocondrial afectará la disponibilidad de combustible a la periferia y se refleja en cambios en el consumo de oxígeno o RCR.
Cambios de consumo de oxígeno mitocondrial en respuesta a la inflamación. Pollos de siete días de edad fueron asignados aleatoriamente a un grupo de infectados con Eimeria maxima y un grupo de control4. Pollos que no se someten a desafío de coccidiosis tenían menor consumo de oxígeno debido a la pérdida de protón y RCR superior indicando que las mitocondrias hepáticas responden a un reto inmunológico por creciente fuga de protones. Escape de protones y reactiva producción de especies de oxígeno una vez era considerado un signo de disfunción de la membrana mitocondrial y perjudicial para la eficiencia energética, ahora se sabe que es importante para la importación de proteínas y calcio en la mitocondria5 y para la generación de calor1.
Escape de electrones de la cadena respiratoria hace mitocondrias susceptibles a la producción de especies reactivas del oxígeno y el daño oxidativo a las proteínas de la membrana mitocondrial, lípidos y ADN mitocondrial. Medida que envejecen las mitocondrias, se puede acumular daño especialmente a mtDNA causando más disfunción en el metabolismo mitocondrial6 y una mayor susceptibilidad de la vaca a la enfermedad. En la práctica, muchos animales de ganado son alimentados con altos niveles de suplementos tales como Cu, Zn y Mn para impulsar la función antioxidante. Sin embargo, alimentando altos niveles de Cu, Zn y Mn disminuyeron la producción de leche y mayor consumo de oxígeno debido a la fuga (estado 4 respiración) de protones7.
Investigación previa sobre el papel de la función mitocondrial en la eficiencia energética en el ganado bovino se ha centrado en cambios en el consumo de oxígeno mitocondrial y la fuga de protones. Muy pocos estudios han sido publicados en ganado lechero y mayoría de los papeles compara la eficacia de la producción en la forma de consumo de alimento residual (RFI) para la función mitocondrial en ganado de carne. Variabilidad en la respiración mitocondrial, las tasas fueron examinadas mediante la medición de estado 3 Estado 4 y RCR en hígados de vacas Holstein y de carne lactantes vacas (Angus, Brangus y Hereford)8. Los investigadores no encontraron ninguna correlación en la respiración mitocondrial con crecimiento o rasgos para ganado de ordeño pero presentaron una correlación entre la respiración mitocondrial y ordeño rasgos para vacas Holstein. En dos estudios, RFI se comparó en bovinos para carne (estado 3 Estado 4 y RCR) de las tasas de respiración mitocondrial en músculo mitocondrias9,10. Cambiaron las tasas de respiración mitocondrial en respuesta a DMI y tarifas fueron asociados con novillos de carne de res menos eficientes. En otro estudio, RFI de novillos de toros altas o bajas RFI se compararon con las tasas de respiración mitocondrial y cinética de pérdida de protones entre los dos grupos de progenie11. Las diferencias fueron por aumento confirmando la conclusión de que ganar hace respiración mitocondrial de no impacto en bovinos para carne.
En este papel, un experimento examinar hígado RCR en respuesta a la alimentación de vacas lecheras lactantes 3 minerales antioxidantes ilustra el uso de métodos para medir el consumo de oxígeno durante 4 y estado 3 la respiración y la fuerza motriz protónica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El punto más crítico en el protocolo es obtener una muestra representativa de tejido hepático y empezando el aislamiento de las mitocondrias tan pronto como sea posible después de la biopsia. Variación en las mediciones de la respiración es baja (tabla 1) debido a un tiempo de transporte corto de la vaca a laboratorio. Para reducir el tiempo de transporte, se estableció un pequeño laboratorio en la oficina de la lechería, y las muestras de hígado fueron conducidas al laboratorio de la oficina c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por Alltech y la USDA Portilla fondos a través del centro para alimento Animal Health en UC Davis escuela de medicina veterinaria.
Materials
| Liver Biopsy | |||
| Equipment | |||
| Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Suture | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Suture needles | NA | NA | Included with Suture |
| Scalpels | Sigma – Aldrich | S2896 / S2646 | # for handle and blades |
| Surgery towels | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon tubes 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Tweezers | Sigma – Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL syringes | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injection needles (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Cow halter | Tractor Supply Co. | 101966599 | |
| Cotton swabbing | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| cotton gauze squares (4×4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medical scissors | Sigma – Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow | Provided by Veterinarian | ||
| Clostridia Vaccine | Provided by Veterinarian | ||
| Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days | Provided by Veterinarian | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma – Aldrich | 793213 | |
| Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight | Provided by Veterinarian | ||
| 2% lidocaine HCl (10-15 mL) | Provided by Veterinarian | ||
| 1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine | Provided by Veterinarian | ||
| Isolation of Mitochondria (liver) | |||
| Equipment | |||
| Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenizer Motor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenizer Probe | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Auto Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Beaker (500 mL) with ice | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Refrigerated microfuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Microfuge tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma – Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma – Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma – Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fatty acid free) | Sigma – Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma – Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionized water | Sigma – Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA, pH 7.4 at 4 °C, will last 2 days in refrigerator | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulated Water Pump | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark type Oxygen electrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Included with Oxy1 |
| Small magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Micropipette (10 μL) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH meter | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma – Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma – Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma – Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma – Aldrich | E3889-100G | |
| Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
| Rotenone (4 mM solution) | Sigma – Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 M solution) | Sigma – Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM solution) | Sigma – Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (solution of 8 μg/mL in ethanol) | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP electrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs | |||
| Malonate (0.1 mM solution) | Sigma – Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μg/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer | Sigma – Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma – Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma – Aldrich | T200 | |
| TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA, pH 7.4 at 30 °C with 0.3% defatted BSA | |||
References
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