嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

鉄や他の金属には活性酸素を利用する酵素は、それらの除去のため細胞の還元環境から浄化プロセス中に不活化を受けやすい。したがって、これらの蛋白質はセル lysates として使用する必要があります、外部の還元剤にさらされるまたは最適な酵素活性^1,2,3,4があるように嫌気浄化されます。これらの酵素は酸素感受性 (具体的には鉄を含む酵素)、嫌気的条件を維持しながらすべての精製と諸性質の手順を実行するそれらを完全に特徴づける必要です。これは、嫌気性チャンバー結晶^{5,6,7,8 を介してタンパク質発現に至る研究の範囲内で全体の研究室のセットアップを開発する研究者をつながっています。}.

ここで、嫌気性の精製と酵素酸素電極を用いた DesB の速度論的解析法を報告する.DesB は、没食子酸ジオキシゲナーゼ細菌Sphingobium sp. ひずみ SYK-6 LigAB、同じ有機体から protocatecuate ジオキシゲナーゼに関連しているからです。日⁹、好気性の標準を使用して精製した場合不活化を受けやすいこのスーパーファミリーの酵素の一部可能性がありますに広範囲に研究されていないタイプ II プロトカテク酸-ジオキシゲナーゼ (PCAD) スーパーファミリーに属する両方の酵素蛋白質の浄化方法。PCAD 酵素のいくつかはありますが基質特異的^2,10, 基板混乱を表示からさらにこのスーパーファミリーの特性評価は特異性の決定要因を識別するために必要です。小さな分子が直接競争の阻害を介して活動またはのバインディングを変更できますいくつか酵素ガ^{11,12,13,14,15}で確認されています別のアロステリック ポケットが増加または減少酵素活性¹⁶する分子。速度だけでは、変調器の結合場所を区別できない、効果を理解するために重要なは活動変化の大きさを決定します。このような DesB のネイティブ アクティビティおよびその活動 4-nitrocatechol (4NC) を特徴付けるジオキシゲナーゼ酵素^2,17,を抑制する一般的に使用される化合物の存在下での速度論的解析法¹⁸日が表示されます。

DesB は、リグニン由来芳香族化合物、基板^10,19の一つとして酸素を使用して開口部を触媒するリングで extradiol ジオキシゲナーゼ (江戸) 反応による没食子酸を分解することができます。この酵素反応は芳香族 heteropolymer は、植物の細胞壁のリグニン分解のコンテキスト内で発生します。リグニンを depolymerized することができます、さまざまな芳香族化合物を降伏するさらに分けることが中央代謝物^{3,20,21,22,2324, ,25,26,27,28,29,30,31,32,33}.Extradiol dioxygenases (江戸) を触媒、胸の谷間が金属配ジオール; に隣接して発生する dihydroxylated 芳香族化合物の反応を開環対照的に、intradiol dioxygenases は、2 つのヒドロキシル グループ (図 1) と芳香族化合物類似を切断します。他の多くの酵素のような EDOs 2 ヒスチジン 1-カルボン酸トライアド^9,34,35から成る調整鉄 (ii) の二価金属センターがあります。これらの酵素は、酵素が非アクティブな^2,36,37,38を表示されるに対し自動酸化、不活性化のメカニズムに基づくと酸化になります。

本稿では、実験手順では、DesB、没食子酸 (図 2 a) の C4 C5 結合に酸素の付加を触媒する細菌Sphingobium sp. SYK-6 から PCAD スーパーファミリーのメンバーを利用します。この胸の谷間の regiochemistry は、プロトカテク酸–4, 5-ジオキシゲナーゼ (図 2 b) は、LigAB に似ています。これまでのところ、この没食子酸ジオキシゲナーゼの調査は、DesB^10,19,39を阻害する化合物のレポートを含めません。有酸素浄化方法の使用は、DesB では、変数の活動を嫌気的方法の使用に一貫して再現可能なアクティビティとタンパク質を取得することができました、出展しました。ここで説明した動力学的研究 DesB、没食子酸と DesB の反応と 4-nitrocatechol (4NC) による DesB の阻害の速度論的解析の嫌気性の浄化メソッドに示します。