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Biochemistry

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Published: October 03, 2018
doi:
10.3791/58307
, , , ,
1Department of Chemistry,Wesleyan University

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für anaerobe Proteinreinigung, anaerobe Proteinkonzentration und anschließende kinetischen Charakterisierung mittels einer Sauerstoff-Elektrode-System. Die Methode wird anhand des Enzyms DesB, ein Dioxygenase Enzym, das ist stabiler und aktiv, wenn gereinigt und in einer anaeroben Umgebung gespeichert.

Abstract

Sauerstoffempfindlichen Proteine, einschließlich jene Enzyme, die Sauerstoff als Substrat, nutzen können Stabilität wenn gereinigt mit traditionellen aerobic Reinigungsverfahren reduziert haben. Diese Handschrift zeigt die technischen Details der anaeroben Reinigungsprozess, einschließlich der Vorbereitung der Puffer und Reagenzien, die Methoden für die Säulenchromatographie in einem Handschuhfach und die Entsalzung des Proteins vor Kinetik beteiligt. Ebenfalls beschrieben sind die Methoden für die Erstellung und Verwendung einer Sauerstoffelektrode zur kinetischen Charakterisierung eines Enzyms, Verwendung von Sauerstoff. Diese Methoden werden anhand der Dioxygenase Enzym DesB, ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6.

Introduction

Enzyme, die Eisen oder anderen Metallen Sauerstoff aktivieren nutzen sind oft anfällig für Inaktivierung während des Reinigungsprozesses aufgrund ihrer Entfernung von den reduzierenden Umgebung einer Zelle. Daher diese Proteine als Zelle Lysates verwendet werden müssen, externe Reduktionsmittel ausgesetzt werden oder anaerob gereinigt werden, um sicherzustellen, dass sie optimale enzymatische Aktivität1,2,3,4. Für diese Enzyme, die sind ist sauerstoffempfindlichen (speziell Eisen-haltige Enzyme), all den Schritten Aufreinigung und Charakterisierung unter Beibehaltung der anaerobe Bedingungen notwendig, sie vollständig zu charakterisieren. Dies hat dazu geführt, Forscher, gesamte Labor Aufbauten innerhalb der Grenzen des anaeroben Kammern für Studien von Protein-Expression durch Kristallographie5,6,7,8 bis hin zu entwickeln .

Hier berichten wir über Methoden zur anaeroben Reinigung und kinetischen Charakterisierung des Enzyms DesB mit einem Sauerstoff-Elektrode-System. DesB ist ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6, die mit LigAB, eine Protocatecuate-Dioxygenase aus dem gleichen Organismus zusammenhängt. Beide Enzyme gehören zu den Typ II Protocatechuate Dioxygenase (PCAD)-Superfamilie, die bis Datum9, wahrscheinlich teilweise durch Enzyme dieser Superfamilie wird anfällig für Inaktivierung wenn gereinigt, mit Standard-aerobic nicht umfassend untersucht worden Protein-Reinigungsverfahren. Da einige der PCAD Enzyme Substrat Promiskuität angezeigt, während andere Substrat-spezifische2,10, muss weitere Charakterisierung dieser Superfamilie Spezifität Determinanten identifizieren. Wie in mehreren Enzym Superfamilies11,12,13,14,15festgestellt wurde, können kleine Moleküle Aktivität über direkte wettbewerbsfähig Hemmung oder die Bindung von ändern Moleküle zu trennen allosterische Taschen, wodurch eine Zunahme oder Abnahme der Enzymaktivität16. Während Kinetik allein die bindende Lage ein Modulator unterscheiden kann, ist das Bestimmen der Größe der Änderung einer Aktivität wichtig für das Verständnis der Auswirkungen. Als solcher, Methoden zur kinetischen Charakterisierung von native DesB Tätigkeit und seine Tätigkeit in Gegenwart von 4-Nitrocatechol (4NC), eine Substanz, die häufig verwendet, um zu charakterisieren und hemmen Dioxygenase Enzyme2,17, 18, werden angezeigt.

DesB ist in der Lage zu brechen in welcher Ring Eröffnung katalysiert wird mit Sauerstoff als einem der Substrate10,19Gallat, eine Lignin-abgeleitete aromatische Verbindung, über eine Extradiol-Dioxygenase (EDO)-Reaktion. Diese enzymatische Reaktion tritt im Rahmen der den Abbau von Lignin, einem aromatischen Heteropolymer gefunden in der Zellwand von Pflanzen. Lignin depolymerisiert werden kann, einer Vielzahl von aromatischen Verbindungen, die nachgeben kann weiter unterteilt werden in zentralen Metaboliten3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol Dioxygenases (EDO) katalysieren einen Ring Eröffnung Reaktion auf Dihydroxylated aromatischen Verbindungen, wo Spaltung angrenzend an ein Metall koordiniert Diol auftritt; im Gegensatz dazu Spalten Intradiol Dioxygenases analoge aromatische Verbindungen zwischen den beiden Hydroxylgruppen (Abbildung 1). EDOs, wie viele andere mechanistische haben eine zweiwertige Metallzentrum für koordinierende Fe(II), bestehend aus einem zwei-Histidin, eins-carboxylat Triade9,34,35. Diese mechanistische werden entweder durch Autoxidation oder Mechanismen basierenden Inaktivierung, oxidiert, während das Enzym inaktiv2,36,37,38gerendert wird.

In der experimentellen Verfahren, die in dieser Handschrift beschrieben nutzen wir DesB, ein Mitglied der PCAD-Superfamilie aus dem Bakterium Sphingobium SP. SYK-6, um die Zufuhr von Sauerstoff über die C4-C5-Anleihe der Gallat (Abbildung 2A) katalysieren. Die Regiochemistry der dieser Spaltung ist analog zum LigAB, ein Protocatechuate-4,5-Dioxygenase (Abb. 2 b). Bisher gehören Untersuchungen zu diesem Gallat Dioxygenase keine Berichte von Verbindungen, die DesB10,19,39hemmen. Mit dem Einsatz von aeroben Reinigungsverfahren ausgestellt DesB schwankende Aktivität, während wir mit dem Einsatz von anaeroben Methoden konsequent Protein mit reproduzierbaren Aktivität erhalten konnten. Die kinetischen Untersuchungen beschrieben hier zeigen die Methoden für die anaerobe Reinigung von DesB, kinetischen Charakterisierung von der Reaktion des DesB mit Gallat und die Hemmung der DesB von 4-Nitrocatechol (4NC).

Protocol

1. Allgemeine Materialien und Methoden Bereiten Sie die erforderlichen Medien, wie in Tabelle 1beschrieben. Autoklaven bei 120 ° c für 15 min. Steril filtern die SOC-Lösung nach Zugabe von MgCl2 und Glukose, indem man es durch einen 0,2 µm-Filter. Stellen Sie den pH-Wert des Müllers Lysogeny Brühe (LB Medien) Lösung vor dem Autoklavieren. Ergänzen Sie die LB-Amp-Media-Lösung nach dem Autoklavieren mit sterilen Lösungen von 0,2 mM L-Cystein, dann 0,1 mM Eisen Ammoniumsulfat,…

Representative Results

Gezeigt wird die SDS-PAGE Gelanalyse der einzelnen Fraktionen von Reinigung des DesB-Maltose Binding Protein (MBP) Fusion Konstrukts (Abbildung 3). Das Gel zeigt, dass das Protein pur (MW = 91.22 kDa), mit Ausnahme der Anwesenheit von DesB (MW = 49.22 kDa) und MBP Protein-Domäne (42 kDa) voneinander gespalten. Brüche-E2 und E3 wurden für Konzentration (Schritt 4.2) ausgewählt. Reproduzierbare Er…

Discussion

Die entscheidenden Schritte bei der Beschaffung von aktiven, gereinigten DesB Protein beinhalten die Bildung und Aufrechterhaltung der reduzierten Fe(II) aktiven Seite im Enzym. Als solche korrigieren Leistung von Induktion, Reinigung, Konzentration und Entsalzung Schritte sind unerlässlich, um aktives Enzym erfolgreich zu erhalten. Induktion der Proteinexpression in Anwesenheit von Eisen Ammoniumsulfat 1 mM sorgt dafür, dass Fe(II) aktiven Seite des DesB korrekt eingebaut ist. Diese Methode orientiert sich an Studien …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Dr. Camille Keller der Wesleyan University für technische Unterstützung zu danken. Besonderer Dank geht an Professor Lindsay D. Eltis sowie Jenna K. Capyk von der University of British Columbia und Christian Whitman von der University of Texas at Austin, für ihre Beratung über anaerobe Protein Reinigungsverfahren und die Verwendung von einem O2 -empfindliche Elektrode.

Materials

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500
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References

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Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).
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