JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Published: October 03, 2018
doi:
10.3791/58307
, , , ,
1Department of Chemistry,Wesleyan University

Summary

כאן אנו מציגים עבור טיהור חלבון אנאירובית, ריכוז חלבון אנאירובית, ואפיון עוקבות קינטי משתמש במערכת אלקטרודה חמצן פרוטוקול. השיטה מומחש באמצעות האנזים DesB, אנזים dioxygenase אשר פעיל כאשר מטוהרים ומאוחסנים בסביבה אנאירובית ויציבה יותר.

Abstract

חלבונים חמצן רגישים, כולל לאנזימים אשר מנצלים חמצן כמו מצע, יכול הפחיתו יציבות כאשר מטוהר בשיטות מסורתיות טיהור אירובי. כתב יד זה ממחיש את הפרטים הטכניים מעורב בתהליך טיהור אנאירובית, כולל הכנת מאגרי, ריאגנטים, השיטות עבור עמודה כרומטוגרפיה תא הכפפות, וכן את desalting של החלבון לפני קינטיקה. גם המתוארים הם השיטות להכנה של באמצעות אלקטרודה חמצן כדי לבצע אפיון קינטי של אנזים ניצול חמצן. שיטות אלו מומחשים באמצעות האנזים dioxygenase DesB, dioxygenase מספר של החיידק Sphingobium sp. זן SYK-6.

Introduction

אנזימים לנצל ברזל או מתכות אחרות להפעלת חמצן רגישים לעיתים קרובות איון במהלך תהליך טיהור בגלל הוצאתם מן הסביבה תוך צמצום של תא. לכן, חלבונים אלה חייב לשמש תא lysates, יהיה נתון חיצוני צמצום סוכנים או להיטהר anaerobically כדי להבטיח כי יש להם פעילות אנזימטי אופטימלית1,2,3,4. עבור אלו אנזימים הנמצאים חמצן-רגיש (במיוחד ברזל המכיל אנזימים), ביצוע כל הפעולות לטיהור ואפיון תוך שמירה על תנאים אנאירוביים יש צורך לאפיין אותם באופן מלא. זה הוביל החוקרים לפתח המעבדה כולה set-ups בתחומיו של צ’יימברס אנאירובית ללימודים החל ביטוי חלבון באמצעות קריסטלוגרפיה5,6,7,8 .

במסמך זה, אנו מדווחים על שיטות טיהור אנאירובית ואפיון קינטי של האנזים DesB באמצעות מערכת אלקטרודה חמצן. DesB הוא dioxygenase מספר של החיידק Sphingobium sp. זן SYK-6 הקשורה ל- LigAB, dioxygenase protocatecuate מן האורגניזם באותו. שני אנזימים שייך סוג II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily אשר לא בהרחבה נחקרה עד תאריך9, ככל הנראה באופן חלקי בגלל אנזימים של זה superfamily להיות רגישים איון כאשר מטוהר באמצעות תקן אירובי שיטות טיהור חלבונים. מאז חלק אנזימים PCAD להציג את המצע הפקרות ואילו אחרים הם ספציפיים המצע2,10, נוספות אפיון superfamily הזה יש צורך לזהות גורמים ירידה לפרטים. כפי נצפתה מספר אנזימים superfamilies11,12,13,14,15, מולקולות קטנות יכול לשנות את הפעילות באמצעות עיכוב תחרותי ישירה או עקידת מולקולות להפרדה הכיסים allosteric אשר גורמת לעלייה או לירידה בפעילות אנזימטי16. בעוד קינטיקה לבד לא יכול להבדיל בין המיקום מחייב של אפנן, הקובע שסדר הגודל של שינוי פעילות חשוב להבנת ההשפעות. בתור שכזה, שיטות אפיון קינטי של פעילות DesB מקורי, פעילותה בנוכחות 4-nitrocatechol (4NC), תרכובת נפוץ כדי לאפיין ומעכבות dioxygenase אנזימים2,17, 18, מוצגים.

DesB הוא מסוגל לשבור את מספר, ליגנין-derived ארומטי במתחם, דרך לתגובה dioxygenase (אדו) extradiol בטבעת אשר הוא פתיחת מזורז באמצעות חמצן כאחת סובסטרטים10,19. כזאתי אנזימטי מתרחשת בתוך ההקשר של פירוק של ליגנין, heteropolymer ארומטי נמצאו דופן התא בצמחים. יכול להיות depolymerized ליגנין, מניב מגוון של תרכובות ארומטיות אשר ניתן עוד יותר לפרק לתוך מטבוליטים המרכזי3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (אדו) לעודד טבעת פתיחת התגובה על תרכובות ארומטיות dihydroxylated, שבו המחשוף מתרחשת בסמוך diol בתיאום מתכת; לעומת זאת, intradiol dioxygenases קליב תרכובות ארומטיות מקביל בין שתי הקבוצות הידרוקסיל (איור 1). EDOs, כמו metalloenzymes רבים אחרים, יש מרכז מתכת כלט Fe(II) תיאום מורכב של היסטידין שתיים, אחת-carboxylate שילוש9,34,35. אלה metalloenzymes להיות מחומצן, דרך autoxidation או מבוסס על מנגנון איון, ואילו האנזים מעובד אינו פעיל2,36,37,38.

בפרוצדורות ניסיוני תיאר כתב יד זה, אנו מנצלים DesB, חבר superfamily PCAD מן sp. Sphingobium החיידק SYK-6, כדי לעודד התוספת של חמצן על-פני הקשר C4-C5 של מספר (איור 2 א). Regiochemistry של פצילות הזה הוא מקביל LigAB, שהוא protocatechuate-4, 5-dioxygenase (איור 2B). עד כה, חקירות של dioxygenase מספר זה כוללות אין דיווחים על תרכובות המעכבות DesB10,19,39. עם השימוש של שיטות לטיהור אירובי, DesB הציג פעילות משתנה, בעוד עם השימוש בשיטות אנאירובית הצלחנו לקבל באופן עקבי את החלבון עם פעילות לשחזור. המחקרים קינטי המתוארים כאן מלמדים שיטות טיהור אנאירובית של DesB, אפיון קינטי של התגובה של DesB עם מספר, עיכוב של DesB על ידי 4-nitrocatechol (4NC).

Protocol

1. כללי חומרים ושיטות להכין בכל אמצעי התקשורת הדרושים כמתואר בטבלה 1. אוטוקלב-120 הלעפה תרוטרפמט במשך 15 דקות סטרילי לסנן את הפתרון SOC, לאחר התוספת של MgCl2 , גלוקוז, על ידי העברתו דרך מסנן 0.2 µm. להתאים את ה-pH של הטוחן פתרון מרק Lysogeny (מדיה ליברות) לפני autoclaving. תוספת הפתרון מדיה LB-Amp…

Representative Results

המוצג הוא ניתוח ג’ל מרחביות-דף של שברים בודדים מטיהור של הבונה פיוז’ן (איור 3) חלבון (MBP) מחייב DesB-מלטוז. הג’ל מגלה כי החלבון הוא טהור (MW = 91.22 kDa), למעט הנוכחות של DesB (MW = 49.22 kDa) ובתחום MBP חלבון (42 kDa) ביקע אחד מהשני. שברים E2 ו- E3 נבחרו ריכוז (שלב 4.2). <p class="jove_content" fo:keep-to…

Discussion

השלבים הקריטיים בהשגת חלבון DesB פעיל, מטוהרים לערב היווצרות ושמירה של האתר הפעיל Fe(II) מופחתת של האנזים. ככזה, לתקן ביצועים של אינדוקציה, היטהרות, ריכוז, desalting צעדים חיוניים להשגת בהצלחה אנזים פעיל. גרימת ביטוי חלבון בנוכחות 1 מ”מ ברזלי אמוניום סולפט מבטיחה כי Fe(II) הוא שולב בצורה נכונה האתר הפעי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות. דר ‘ קלר קאמי מתה האוניברסיטה לקבלת תמיכה טכנית. תודה פרופסור לינדזי ד Eltis ו ג’נה Capyk ק מ אוניברסיטת בריטיש קולומביה, וכן כריסטיאן וויטמן של אוניברסיטת טקסס באוסטין, מיוחדת על עצתם לגבי שיטות טיהור חלבונים אנאירובית ושימוש של האוריאולס2 -אלקטרודה רגיש.

Materials

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -. L., Tainer, J. A., David, S. S. . Methods in Enzymology. 599, 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).

Tags

AnaerobicProtein PurificationKinetic AnalysisOxygen ElectrodeDesB DioxygenaseEnzyme ActivityInhibitionInorganic BiochemistryOxygen-sensitive MetalsProtein ExpressionCell PelletAmylose ColumnLysozymeHigh-pressure HomogenizationNitrogen GasGlove BoxAmylose Column BufferElution BufferFerrous Ammonium SulfateDithiothreitol

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image