Purification de protéine anaérobie et l’analyse cinétique via la sonde à oxygène pour l’étude de l’Inhibition et l’activité DesB Dioxygenase

Les enzymes qui utilisent le fer ou autres métaux pour activer l’oxygène sont souvent sensibles à l’inactivation au cours du processus de purification en raison de leur éloignement de l’environnement réducteur d’une cellule. Par conséquent, ces protéines doivent servir de lysats cellulaires, être soumis à des agents réducteurs externes ou être purifiés par voie anaérobie pour s’assurer qu’ils ont une activité enzymatique optimale^1,2,3,4. Pour ces enzymes qui sont sensibles à l’oxygène (enzymes contenant du fer plus précisément), effectuer toutes les étapes de purification et caractérisation tout en maintenant des conditions anaérobies est nécessaire pour caractériser complètement à eux. Cela a conduit les chercheurs à élaborer des montages tout laboratoire dans l’enceinte des chambres anaérobies d’études allant de l’expression de la protéine par cristallographie^5,6,7,8 .

Dans les présentes, nous rapportons les méthodes d’épuration anaérobie et caractérisation cinétique de l’enzyme DesB à l’aide d’un système d’électrodes de l’oxygène. DesB est une dioxygénase gallate de la bactérie Sphingobium SP. souche SYK-6 qui est lié à LigAB, une dioxygénase protocatecuate partir du même organisme. Les deux enzymes appartiennent à la superfamille des dioxygénase (DGPAM) protocatéchuate de type II qui n’a pas été étudiée date⁹, probablement en partie due à des enzymes de cette superfamille sont sensibles à l’inactivation quand purifié à l’aide de la norme aérobique méthodes de purification des protéines. Puisque certains enzymes DGPAM affichent promiscuité de substrat, tandis que d’autres sont spécifiques à substrat^2,10, plus loin la caractérisation de cette superfamille est nécessaire d’identifier les déterminants de la spécificité. Comme a été observée dans plusieurs enzymes super-familles^{11,12,13,14,15}, petites molécules peuvent modifier l’activité par l’intermédiaire de l’inhibition compétitive directe ou la liaison de molécules à séparer les poches allostériques qui provoque une augmentation ou diminution de l’activité enzymatique¹⁶. Alors que la cinétique seul ne peut pas différencier l’emplacement de la reliure d’un modulateur, l’amplitude d’un changement d’activité est important pour comprendre les effets. En tant que telles, méthodes de caractérisation cinétique du DesB native et son activité en présence de 4-nitrocathécol (4NC), un composé utilisé couramment pour caractériser et inhiber dioxygénase enzymes^{2,17, 18}, sont indiqués.

DesB est capable de décomposer gallate, un composé, via une réaction de dioxygénase (EDO) extradiol dans quel anneau ouverture est catalysée par l’oxygène comme l’un des substrats^10,19d’aromatique dérivés de la lignine. Cette réaction enzymatique se produit dans le cadre de la décomposition de la lignine, un hétéropolymère aromatique se trouvée dans la paroi cellulaire des plantes. La lignine peut être dépolymérisée, produisant une variété de composés aromatiques qui peut être subdivisée en métabolites central^{3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33} . Extradiol dioxygénases (EDO) catalysent un anneau ouverture réaction dihydroxylé de composés aromatiques, où clivage se trouve en bordure d’un diol métal coordonnés ; en revanche, intradiol dioxygénases clivent les composés aromatiques analogues entre les deux groupes hydroxyle (Figure 1). ADE, comme de nombreux autres métalloenzymes, ont un centre métallique divalent pour coordination Fe (II) composé d’un deux-histidine, un-carboxylate triade^9,34,35. Ces métalloenzymes devient oxydés, par autooxydation ou axée sur le mécanisme d’inactivation, alors que l’enzyme est rendu inactif^2,36,37,38.

Dans les procédures expérimentales décrites dans ce manuscrit, nous utilisons le DesB, un membre de la superfamille DGPAM de la bactérie Sphingobium SP SYK-6, à catalyser l’apport d’oxygène à travers la liaison de C4-C5 de gallate d’Epigallocatechin (Figure 2 a). La régiochimie de ce clivage est analogue à LigAB, qui est une protocatéchuate-4,5-dioxygénase (Figure 2 b). Jusqu’ici, enquêtes de cette dioxygénase gallate n’incluent aucun signalement de composés qui inhibent le DesB^10,19,,³⁹. Avec l’utilisation des méthodes de purification aérobie, DesB a manifesté une activité variable, alors qu’avec l’utilisation de méthodes anaérobies, nous avons pu obtenir régulièrement les protéines à activité reproductible. Les études cinétiques décrites ici montrent les méthodes d’épuration anaérobie du DesB, caractérisation cinétique de la réaction du DesB avec gallate et l’inhibition du DesB par 4-nitrocathécol (4NC).