Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90
Summary
Qui presentiamo un protocollo per la purificazione della proteina anaerobica, la concentrazione di proteina anaerobica e successiva caratterizzazione cinetica utilizzando un sistema di elettrodi di ossigeno. Il metodo è illustrato utilizzando l’enzima Giuroma90, un enzima diossigenasi che è più stabile e attivo quando purificato e conservati in un ambiente anaerobico.
Abstract
Proteine sensibili all’ossigeno, compresi quegli enzimi che utilizzano ossigeno come substrato, possono hanno ridotto la stabilità quando purificato utilizzando metodi di depurazione aerobica tradizionale. Questo manoscritto illustra i dettagli tecnici coinvolti nel processo di depurazione anaerobica, compresa la preparazione dei tamponi e reagenti, i metodi per cromatografia su colonna in un vano portaoggetti e la desalificazione della proteina prima della cinetica. Sono anche descritti i metodi per la preparazione e l’utilizzo di un elettrodo di ossigeno per eseguire la caratterizzazione cinetica di un enzima che utilizzano ossigeno. Questi metodi sono illustrati usando l’enzima diossigenasi Giuroma90, un dioxygenase di gallato del batterio Sphingobium ceppo SP. SYK-6.
Introduction
Enzimi che utilizzano ferro o altri metalli per attivare ossigeno sono spesso suscettibili di inattivazione durante il processo di purificazione a causa della loro rimozione dall’ambiente riducente di una cella. Di conseguenza, queste proteine devono essere utilizzate come lisati cellulari, essere sottoposte agli agenti riducenti esterni o essere purificate anaerobicamente per garantire che essi hanno attività enzimatica ottimale1,2,3,4. Per quegli enzimi che sono sensibili all’ossigeno (in particolare ferro-contenenti enzimi), esecuzione di tutte le fasi di purificazione e caratterizzazione mantenendo condizioni anaerobiche sono necessario caratterizzare completamente loro. Questo ha portato i ricercatori a sviluppare configurazioni intero laboratorio entro i confini di anaerobiche alloggiamenti per gli studi che vanno dall’espressione della proteina attraverso cristallografia5,6,7,8 .
Qui, segnaliamo i metodi per la purificazione anaerobica e caratterizzazione cinetica dell’enzima Giuroma90 utilizzando un sistema di elettrodi di ossigeno. Giuroma90 è un dioxygenase di gallato del batterio Sphingobium ceppo SP. SYK-6 che è legato al LigAB, un dioxygenase di protocatecuate dallo stesso organismo. Entrambi gli enzimi appartengono alla superfamiglia di diossigenasi (PCAD) tipo II protocatecuato che non è stata studiata estesamente a data9, probabilmente in parte a causa di enzimi di questa superfamiglia essendo suscettibile di inattivazione quando purificato utilizzando standard aerobica metodi di purificazione della proteina. Poiché alcuni degli enzimi PCAD visualizzare promiscuità di substrato, mentre altri sono substrato specifico2,10, ulteriore caratterizzazione di questa superfamiglia è necessario individuare fattori determinanti di specificità. Come è stato osservato in diversi enzimi superfamilies11,12,13,14,15, piccole molecole possono alterare attività tramite inibizione competitiva diretta o l’associazione di molecole per separare le tasche allosterici che causa un aumento o diminuzione di attività enzimatica16. Mentre cinetica da solo non può distinguere il percorso di associazione di un modulatore, determinare la grandezza di un cambiamento di attività è importante per comprendere gli effetti. Come tali, metodi per la caratterizzazione cinetica di attività nativa di Giuroma90 e la sua attività in presenza di 4-nitrocatechol (4NC), un composto comunemente utilizzato per caratterizzare e inibire diossigenasi enzimi2,17, 18, sono mostrati.
Giuroma90 è in grado di abbattere gallato, un composto, tramite una reazione di diossigenasi (EDO) extradiol in quale anello di apertura è catalizzata usando ossigeno come uno dei substrati10,19lignina-derivato aromatico. Questa reazione enzimatica si verifica all’interno del contesto della ripartizione della lignina, un aromatico heteropolymer trovato nella parete cellulare delle piante. Lignina può essere depolimerizzato, producendo una varietà di composti aromatici che può essere suddiviso in metaboliti centrale3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol diossigenasi (EDO) catalizzano un reazione su composti aromatici dihydroxylated, cui scissione si verifica adiacente un diolo metallo-coordinato; di apertura dell’anello al contrario, intradiol diossigenasi fendono analoghi composti aromatici tra i due gruppi di idrossile (Figura 1). Evandri, come molti altri metalloenzymes, dispone di un centro di metalli bivalente per coordinamento Fe (II) composto da una due-istidina, uno-carbossilato triade9,34,35. Questi metalloenzimi ossidarsi, tramite autossidazione o basati sul meccanismo di inattivazione, considerando che l’enzima è reso inattivo2,36,37,38.
Nelle procedure sperimentali descritte in questo manoscritto, utilizziamo Giuroma90, un membro della superfamiglia PCAD da SYK-6, il batterio Sphingobium SP., per catalizzare l’aggiunta di ossigeno attraverso il legame C4-C5 di gallato (Figura 2A). La regiochimica di questa scissione è analoga a LigAB, che è un protocatecuato-4,5-diossigenasi (Figura 2B). Finora, le indagini di questo diossigenasi gallate non includono nessun rapporti di composti che inibiscono la Giuroma9010,19,39. Con l’uso di metodi di depurazione aerobica, Giuroma90 ha esibito l’attività variabile, mentre con l’uso di metodi anaerobici siamo riusciti a ottenere costantemente proteina con attività riproducibile. Gli studi cinetici descritti qui mostrano i metodi per la purificazione anaerobica di Giuroma90, caratterizzazione cinetica della reazione di Giuroma90 con gallato e l’inibizione di Giuroma90 di 4-nitrocatechol (4NC).
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi critici nell’ottenere attiva, purificata proteina Giuroma90 coinvolgono la formazione e il mantenimento del sito attivo Fe (II) ridotto nell’enzima. Come tale, correggere le prestazioni dell’induzione, purificazione, concentrazione e dissalazione passaggi sono essenziali per ottenere con successo enzima attivo. Che induce l’espressione della proteina in presenza di solfato ferroso dell’ammonio di 1 mM assicura che Fe (II) correttamente è incorporato nel sito attivo del Giuroma90. Questo metodo è ispirato da …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la dottoressa Camille Keller di Wesleyan University per il supporto tecnico. Grazie professore Lindsay D. Eltis e Jenna K. Capyk dalla University of British Columbia, come pure Christian Whitman dall’Università del Texas ad Austin, speciale per i loro consigli per quanto riguarda i metodi di purificazione della proteina anaerobica e l’utilizzo di un O2 -elettrodo sensibile.
Materials
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
| Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
| N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
| Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
| BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
| 4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
| Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
| Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
| wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
| 25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
| 400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
| 76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
| DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
| Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
| 2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
| Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
| Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
| Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
| PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
| Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
| Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
| He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
| Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
| 10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
| DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
| Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
| B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
| ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
| Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
| Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |
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