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Bioengineering

Microbioreactor uso de alto rendimiento automático para la producción de IgG1 modelo en células CHO

Published: September 28, 2018
doi:
10.3791/58231
, , , , , , , ,
1Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II,U.S. Food and Drug Administration

Summary

Se presenta un protocolo detallado para la operación concurrente de culturas de célula paralelo 48 bajo variadas condiciones en un sistema de microbioreactor. Proceso de cultivo celular, la cosecha y el análisis del título de anticuerpos posterior se describen.

Abstract

Biorreactores de microescala automatizado (15 mL) pueden ser una herramienta útil para los ingenieros de la cultura de célula. Facilitan la ejecución simultánea de una amplia variedad de condiciones experimentales y reducir al mínimo variabilidad potencial de proceso. Las aplicaciones de este enfoque incluyen: copia proyección, cambios de temperatura y pH, optimización de medios de comunicación y suplemento. Además, los volúmenes de reactor pequeño son propicios para el gran diseño de los experimentos que investigan una amplia gama de condiciones. Esto permite que procesos upstream optimizarse considerablemente antes de escalar donde experimentación es más alcance limitada debido al tiempo y las restricciones económicas. Sistemas de biorreactor de microescala automatizados ofrecen diversas ventajas sobre el tradicional a pequeña escala unidades de cultivo de células, tales como agitar matraces o frascos de spinner. Sin embargo, en escala piloto proceso desarrollo significativo debe tener cuidado para asegurar que se realizan estas ventajas. Cuando se ejecuta con cuidado, el sistema permite la automatización de nivel alto, puede ser programado para funcionar de DOE con un mayor número de variables y puede reducir el tiempo de muestreo cuando se integra con un analizador de nutrientes o un contador de células. Integración de la heurística derivados del experto presentada aquí, con experimentos de biorreactor automatizado microescala actual puede minimizar errores comunes que impiden resultados significativos. En el extremo, no apegarse a los principios establecidos aquí puede conducir a daño al equipo que requiere reparaciones costosas. Además, los sistemas microbioreactor tienen volúmenes de pequeña cultura dificulta la caracterización de las condiciones de cultivo celular. El número y la cantidad de muestras tomadas en proceso en la cultura de modo de lote es limitada como volúmenes de funcionamiento no inferiores a 10 mL. Este método discuten las ventajas e inconvenientes de los sistemas del biorreactor de microescala.

Introduction

Anticuerpos monoclonales (mAbs) primero fueron producidos en las células de hibridoma de ratón en 19751. Desde entonces, un aumento en el desarrollo de la producción de proteína recombinante ha tenido lugar a humanizar mAbs aumento en vivo seguridad y eficacia2,3,4. La mayoría de los procesos de producción de proteínas recombinantes emplea células de ovario de hámster chino (CHO) por la facilidad con que pueden ser adaptados a los medios libres de suero, su capacidad para producir proteínas con modificaciones post-traduccionales similares a la de un humano innato proteína y su fiabilidad como anfitrión células5,6.

La demanda está creciendo para ofrecer el producto más rápido y para poblaciones de pacientes más grandes con una calidad constante. Además de los beneficios económicos, está aumentando el repertorio de patologías tratadas por mAbs, que ahora incluye enfermedades autoinmunes, complicaciones post-trasplantes, artritis y cáncer7. Rendimientos promedio para mAb comerciales modernas líneas de producción son típicamente en el rango de 5-6 g/L y continúan aumentando5. En parte, esto se ha logrado mediante ingeniería de células CHO y el análisis de la línea de producción mejorada utilizando biorreactores de alto rendimiento8. Sin embargo, se han atribuido más incrementos en la producción de proteínas para procesar mejoras, incluyendo los avances en la optimización de los medios de comunicación, las condiciones de cultivo celular y mejorado la alimentación estrategias7,9,10. La suplementación de nutrientes es esencial no sólo para el crecimiento celular adecuado sino también para la producción eficiente de proteínas de alta calidad. Además, las células requieren la adición estequiométrica de nutrientes específicos, que requieren entendimiento adicional para alimentar estrategia optimización6,11. Métodos de optimización tradicionales incluyen la valoración del componente de medios individuales y medios de comunicación con diseños de mezcla. Sin embargo, estos métodos son mucho tiempo, mano de obra intensivo e implican riesgos de error humano12,13.

Estudios de optimización de los medios de comunicación previamente confiaban en agitar matraces y bioreactores de 1-2 L que pueden ser prohibitivos en términos de materias primas y capital humano. También se han utilizado placas pero estos métodos proporcionan escalabilidad limitada. Además, esto todavía puede requerir varios funcionamientos desperdiciadores de tiempo que introducen variabilidad de lote a lote que oscurece la variabilidad CQA causada por la composición de los medios de comunicación y alimentación estrategia14,15,16. Por lo tanto, la necesidad de alto rendimiento y altamente consistente biorreactor paralelo sistemas surgieron17,18,19,20.

Con el costo significativo asociado con la operación de biorreactores de báscula de mesa tradicionales (0.5-5 L), microbioreactors ofrecer una alternativa de reducción de costos para evaluar biológicamente la producción de derivados de drogas. 21 -báscula de mesa de biorreactores de tanque agitado son confiables y proporcionan datos densos por medio de matrices sensoriales. Sistemas de control de retroalimentación permiten fácil supervisión de la operación. Sin embargo, el montaje, calibración, limpieza, los costos laborales, sustrato costos y requisitos de esterilización hacen biorreactores de tanque agitado-Balanzas costosos y mano de obra intensiva para operar. Agitar matraces y las placas de microtitulación quitar algunos de los costos y problemas relacionados con biorreactores de escala más grandes de la mano de obra, pero estas alternativas proporcionan un débil control sobre las condiciones de procesamiento y datos de baja densidad, a menudo solamente las mediciones de punto final. 22

Alternativamente, microbioreactors utilizar un pequeño volumen de trabajo para proporcionar un enfoque de escala hacia abajo a línea celular y el desarrollo del proceso por aguas arriba. La escala de los experimentos de microbioreactor puede disminuir perceptiblemente coste corriente a través del menor uso de energía, sustrato, mano de obra, espacio y utilidades. 23 Microbioreactors son como agitar matraces que son fáciles de manejar debido a su tamaño, pero conservan las ventajas de biorreactores Balanzas tradicionales a través del control feedback en línea de pH, temperatura, oxígeno disolución y ácido/base consumo, así como su salida de datos en tiempo real de parámetros de calidad incluyendo fuera de la composición del gas. Escala de Microbioreactor permite la capacidad de proyección de alto rendimiento, que puede ser útil para el desarrollo de proceso de selección y copia. 24

El biorreactor de microescala avanzada ha demostrado ser una herramienta eficaz para la caracterización de proceso CHO de la célula cultura y desarrollo18. Aquí, un sistema automatizado ambr15, consistiendo en 48 microbioreactors en paralelo, que han demostrado ser comparables al clásico revuelto de reactores de tanque en escala estudios,25 fue utilizado en una manera análoga al trabajo previo que optimizan los medios de comunicación composición para una línea de células de CHO-DG44 produciendo un modelo quimérico IgG16. Los efectos de diferentes condiciones de los medios de comunicación en crecimiento y un título fueron en comparación y analizados. En este trabajo se presenta una guía general para ejecutar el sistema de microbioreactor y análisis de muestras de crudo media.

Protocol

1. semilla de tren expansión Nota: Este protocolo utiliza 1 mL recombinante DG44 CHO celular las acciones que se han almacenado en una densidad de ~ 3 x 107 células/mL. Las diluciones y los plazos para las líneas celulares CHO individuales varían. Medir las curvas de crecimiento de la línea celular para ser utilizado previamente y ajustar en consecuencia. Las células son descongeladas inicialmente en agitar matraces y más tarde transferidas a un matraz de spinner. Determinar el número de sacudidas y el spinner es necesario para el experimento basado en el número de microbioreactors que se llevará a cabo y el objetivo de densidad de siembra. Descongelar rápidamente frascos comunes de las células CHO por inmersión en un baño de agua de 37 ° C hasta que sólo una pequeña astilla de restos de hielo. Descontaminar el exterior del frasco con solución de etanol 70% y una pelusa. Transferir a un gabinete de bioseguridad. Resuspenda las células por suavemente hacia arriba y hacia abajo el pipeteo y transferir 1 mL a un frasco de batido de ventilación estéril 125 mL que contenga los medios de comunicación con 29 mL, suplementados con L-glutamina de 8 mM y 1 x penicilina/estreptomicina.Nota: Salvo indicación en contrario, el término “medios” en el presente Protocolo se definirá en adelante como medio de OptiCHO. Lugar agitar Deutsch en una incubadora mantenida a 37 ° C y 8% CO2. Use un agitador orbital para agitar las células a una velocidad de 130 rpm. Controlar la densidad de células viables (VCD) todos los días usando una célula automatizada contando dispositivo o manualmente con un hemocitómetro y trypan blue. Subcultura (diluido) las células de 72 horas después de la inoculación en medios de comunicación fresco (caliente previamente los medios de comunicación a 37 ° C, cada vez que hay que añadir a las células) que el volumen final es de 100 mL en un matraz de 125 mL spinner. Incubar las culturas spinner en las mismas condiciones que se utiliza para agitar las culturas de matraz a una velocidad de 70 rpm.Nota: Después de subcultura, las células deben estar en una densidad de 0.7-1 x 106 células/mL. Asegúrese de que la densidad final no esté por debajo de 0,5 x 106 células/mL. Subcultura después de 96 h si no se logra la densidad celular de destino para la inoculación en Hilanderos. En el tercer día (un día antes de la preparación de inóculo), añadir medio fresco precalentado a spinner-Deutsch mantener ≥ 90% de viabilidad. No exceda el volumen total de 125 mL. 6 2. funcionamiento del sistema automatizado microbioreactor Requisitos: Usuario debe haber recibido la formación adecuada del fabricante y debe estar familiarizado con la seguridad y condiciones de funcionamiento para el sistema. Inicialización y la conexión a contador de células Inicializar el sistema operativo el software. Antes de abrir el software, asegúrese de que el contador de célula (véase Tabla de materiales) está ejecutando junto con el software respectivo. El contador de célula está integrado con el sistema. Conexión a conexión remota del contador celular antes de abrir el software. Haga clic en el icono del escritorio remoto y haga clic en “Conectar”. Una vez conectado el escritorio remoto, abra el software de contador de células. Instalar un nuevo juego de reactivos, vacía el azul trypan residuos y cebe el sistema. Minimizar la conexión remota y abra el software de micro del biorreactor usando un experimento existente como una plantilla para crear un nuevo experimento. Nombre y guarde el experimento. Asegúrese de que el contador de células automatizado está conectado debajo de la ficha en el software. El estado puede comprobarse también en el software de contador de células. Definición de las placas y los buques de cargaNota: por favor consulte la figura 1 para orientar la carga de insumos y reactivos en las estaciones de la cultura y cubiertas. Las placas de sujeción deben ser esterilizadas en un gravedad ciclo (utilizado para materiales sólidos) antes. Antes de comenzar una carrera, definir las placas durante el funcionamiento en la sección mímica del software. Cada placa utilizada el nombre y designar cada placa a una plataforma en la estación de cultura de microbioreactor. Utilice una placa de 24 pocillos para cargar los medios de comunicación y coloque sobre la plataforma designada de la estación de la cultura. Colocar 1 mL y 4 mL punta de la pipeta las cajas en las secciones como se indica en la figura 1. Coloque una placa de 24 pocillos inoculación en la cubierta respectiva de la estación de la cultura. Coloque el 1 solo bien tamponada fosfato salino (PBS) placa en cubierta 1. Coloque la placa de NaOH de 1 M single-bien en cubierta 2 y la placa de 24 pocillos antiespumante en la cubierta 7 (las posiciones como se indica en la figura 1). Los números de la cubierta se muestran esquemáticamente en la pestaña de “Imitar” en el software. Desembale los recipientes de cultivo (equipados de sparger) dentro de la campana gabinete de seguridad. Coloque doce recipientes de cultivo estéril en cada estación de la cultura. Lugar esterilizado Sujete las placas en la parte superior de los vasos. Asegurarse de que los orificios insertos para los agitadores todos enfrentan la misma dirección para la colocación más fácil.Nota: Utilizando un marcador permanente, categorizar los recipientes de cultivo antes de colocarlos en la estación de la cultura para ahorrar tiempo y evitar confusiones en el momento de la cosecha. Placa de la abrazadera O-rings son la primera parte de llevar hacia abajo después de autoclavar completamente y repetidamente, por lo tanto comprobar cuidadosamente antes de la esterilización en autoclave antes de cada experimento. Se recomienda mantener una placa pinza estéril como respaldo en caso de fallo de junta tórica. Coloque las placas de revolver encima de las placas de sujeción, asegurando cada perno se inserta firmemente. Fije las placas de fijación con los tornillos y mandos proporcionadas. Apriete las perillas hasta que esten apretadas a mano. Apriete los botones izquierdos y derecho alternativamente para incluso la colocación de la placa de la abrazadera.Nota: Si la pinza no esté al ras contra la superficie o si los tornillos en el extremo de la placa de la abrazadera estén apretados irregularmente, los vasos experimentará problemas de control de oxígeno disuelto (DO). Si estos ajustes no corrige el problema de hacer, compruebe las juntas tóricas como incompleto sellado de placas puede conducir a gasear ineficiente de la cultura. Ejecuta el Software automatizado biorreactor MicroNota: uso “Pasos del proceso” puedes editar o crear nuevos pasos. Pasos deben programarse individualmente para iniciar y detener cualquier proceso. Haga clic en botón de “Insertar paso” en la pestaña de pasos de proceso para crear nuevos pasos o haga doble clic en un paso existente para editar ese paso. Los pasos del programa se dividen en diez secciones principales: Inicio, Media carga, adición de antiespumante, / pH Control, fondo Base de adiciones, pausa pH, inoculación, recuento de células de X 5, conteo X 10, muestreo del analizador de nutrientes y cultura estación de parada. La duración de ejecución es generalmente entre 7-9 días, cuando se ejecuta en modo por lotes. El sistema inicializa y comprueba la presencia de los recipientes adecuados. Escanear el código de barras con los recipientes de cultivo. El mismo código de barras puede aplicarse para las estaciones de la cultura con recipientes vacíos o recipientes no se utiliza. El sistema se iniciará con el programa diseñado después de comprobar control, gas y otras conexiones.Nota: El usuario puede continuar con el programa incluso si un error ocurre, pero lo hace a riesgo del usuario y si continuar adelante no daña el sistema y no interrumpirá el experimento. Por ejemplo, emisión de gases se puede apagar para determinados buques no utilizados en el experimento que se mostrará como un error, pero puede evitarse. Arranque y carga de los medios de comunicación El primer día configurando el sistema o el medio día de carga se designa como día 0 de tiempo de la cultura. En la sección de inicio, primera pipeta de carga consejos, 1 mL y 4 mL, conforme a lo programado. Si ya colocado, haga clic en continuar. Coloque la placa de medios, 1 X PBS, 1 M NaOH, antiespumante placa, placa de carga media y placa de inoculación en las cubiertas designadas o, si ya colocado, presione continuar pasar al siguiente paso. Como parte del Protocolo de inicio, comenzar el control de la temperatura y temperatura de 37 ° C. Encienda la agitación de 1000 rpm y el DO monitor de pH. A continuación, ejecutar los medios de comunicación programa de carga. El controlador de líquido del sistema automatizado microbioreactor dispensará a los medios de comunicación de la placa de los medios de comunicación a los recipientes de cultivo como asignado en el programa. Los medios de comunicación ha añadido son OptiCHO con diferentes condiciones de proceso.Nota: Dos pozos de una placa de 24 pocillos están obligados a llenar un recipiente de la cultura a la capacidad (13 mL), como cada bien sólo puede alojar 8 mL de medio. Utilice 7-8 mL en cada pocillo para evitar aire dibujo cuando los medios de comunicación se se mezcla el líquido controlador antes de cargar. Una vez que se realiza la carga de los medios de comunicación, 35 μl de Antiespumante de Ex-Cell se añadirá de la placa de Antiespumante a la vasija de la cultura. Espere 30 minutos para medio de cultivo para ser bien mezclados y la óptica / sensores de pH para estar hidratado.Nota: Se añade el mismo volumen de Antiespumante intermitentemente a lo largo de tiempo de la cultura cuando se detecta la formación de espuma. 6 espumante se detecta visualmente, y reactores se comprueban todos los días para hacer espuma. Antiespumante es añadido inmediatamente tras la detección. El DO / control del pH se enciende entonces a empezar a controlar y registrar el DO y el pH del medio de cultivo. Permite hacer llegar el punto de 50%, que toma al menos 2 h. Después de hacer equilibrar, encienda adiciones base de fondo para lograr un punto de ajuste de pH de 7.1 para todos los buques de la cultura. Permiten hacer y pH para equilibrar durante la noche y estar completamente hidratado. Pausa pH – pH día 1 Offset Al día siguiente (marcado como día 1), ejecutar el paso pausado del pH que seleccione cultura vasos se analizan y se determina un desplazamiento de la corrección de pH.Nota: El número de buques de pH que se quiera muestrear para compensar el pH es determinado. Una muestra de cada vasija del reactor puede no ser necesaria si usted tiene una buena representación de la población de biorreactor. Coloque las placas de soporte del tubo de muestra en designado cubiertas y tubos de centrífuga micro carga con abren y escondido al lado de ellos. El líquido controlador despachará 600 μl del líquido de cultivo celular en el tubo como asignado en el programa. Retire inmediatamente la muestra y medida de pH en un equipo bioanalyzer nutriente que ha sido calibrado correctamente y que se han ejecutado las QCs (véase abajo, “Nutrientes y metabolitos análisis diario”).Nota: Las muestras se ejecutan individualmente, inmediatamente después del dibujo, para evitar los cambios de pH debido a la exposición al aire, como la desgasificación de CO2 de la muestra puede causar cambios en el pH. Golpe “continuar” después de cada muestra, de lo contrario que no se ejecutará el siguiente paso. Introduzca los valores de pH externo, derivado de FLEX en el software, “compilar” los desplazamientos de los recipientes muestreados automáticamente. Promedio de los desplazamientos obtenidos para los recipientes de muestra y escriba el número en la columna offset de usuario pH bajo la pestaña “Datos de la embarcación” manualmente. El desplazamiento promedio entonces se aplicaría a todos los buques. Permitir que el pH equilibrar durante al menos 2-3 horas, después de que los recipientes de cultivo pueden ser inoculados. Inoculación Después de medir el VCD, transferir el contenido completo del spinner-Deutsch en un estéril, 250 mL centrífuga cónico tubo de pellet y de las células por centrifugación 10 min a 140 x g a temperatura ambiente. Los viejos medios se decanta y se vuelva a suspender en bastantes medios frescos que la densidad final debe ser 1 x 106 células/mL después de añadir el inóculo a la nave de cultura. Añadir las células suspendidas en la señalada de una placa de 24 pozos con tapa estéril. Añadir 3 mL de inóculo a cada bien, de los cuales se eliminarán 2 mL como inóculo para cada buque de la cultura. Coloque la placa de inóculo en la cubierta designada dentro de la campana. Asegúrese de rociar la parte exterior de la placa de inóculo con tapa con alcohol al 70% antes de colocar dentro de la campana. La célula cuenta con automatizado contador celular Después de la inoculación, permita que los recipientes de cultivo alcancen al menos una hora. Después de una hora, ejecutar el 5 X celular cuenta paso en el programa. 5 X indica el factor de dilución utilizado para leer el recuento de células.Nota: recuento de células de X 5 se utiliza inicialmente cuando las células están en fase de retraso. Después de que las células alcanzan su fase exponencial se utilizará el 10 X recuento de células. Basado en la muestra y los volúmenes de diluyentes el instrumento automáticamente representa el factor de dilución y el valor final ajusta en consecuencia. El controlador de líquido primero agrega 480 μl de 1 X PBS a la celda contador copa seguida por la adición de 120 microlitros del fluido de cultivo celular de la vasija de la cultura. El conteo de células entonces se lee usando el contador de células automatizado. Este paso se repite para todos los buques. La cuenta de célula es el último paso para el día 1 de la época de la cultura. Junto con los datos y pH el conteo de datos (densidad celular viable y viabilidad) también se registran diariamente por el software.Nota: Limpie la taza del contador de célula por lo menos dos veces durante la duración de la carrera con IPA 70% para prevenir la obstrucción de líneas. Líneas y celda de flujo se limpian automáticamente después de cada recuento de células. Pausa pH – pH día 2 Offset Día 2 del tiempo de la cultura, repita el paso “Pausa pH” utilizando recipientes de cultivo, distintos de los que fueron muestreados de durante la etapa inicial pH pausado.Nota: Más de la población de buque para pH pausado de muestreo proporcionará un mejor desplazamiento para corrección del pH. Por lo tanto, no muestra los misma buques utilizados para pH pausado del día anterior. Análisis de metabolitos y nutrientes diarios Las muestras se tomarán para el análisis de nutrientes de 2 día de la cultura hasta el final del experimento y analizaron nutrientes bioanalyzer. Coloque las placas de soporte del tubo de muestra en designado cubiertas y tubos de centrífuga micro carga con abren y escondido al lado de ellos. El controlador líquido expulsará el líquido celular en el tubo como asignado en el programa.Nota: Para los primeros días (días 2-4) la cantidad de muestra tomada de la nave de cultura es 300 μl. Esto se diluye con 300 μL de PBS de X 1 por el controlador de líquido. Esto se hace para conservar el volumen cultura y evitar que el nivel caiga por debajo de 10 mL. Además, valores nutritivos para los primeros días caen dentro de la gama de detección del instrumento después de la dilusión. Coloque las muestras en la bandeja del analizador para realizar el análisis de nutrientes.Nota: Congelar las muestras que no serán analizadas en el mismo día. Apagar el sistema Para terminar la carrera, primero apague el control de la temperatura seguido de la agitación. En segundo lugar, dejar de la DO / control del pH y el fondo basan de adiciones. En tercer lugar, deje todos los demás controles. Por último, deje al monitor de sistema. Destornillar la abrazadera y remover placas y eliminar recipientes de cultivo. Limpie el interior de la estación de la cultura con una toallita libre de pelusas. Coloque las placas de sequía en la estación de la cultura y atornillarlas.Nota: Ciclo de secado es necesario para la versión refrescada del sistema y no es necesario para la versión estándar del sistema. Ejecutar el ciclo de secado de 2 horas en el programa. Limpiar las placas de fijación con agua ultrapura seguida de 70% Alcohol isopropílico (IPA) para eliminar el posible líquido condensado en las líneas. Limpie con aire para eliminar cualquier líquido residual. Haga clic en “Stop” en el software de biorreactor una vez ha terminado el ciclo de secado. 3. célula cultura cosecha Transferir el líquido de la cultura de célula de los recipientes del reactor y de la pelotilla de las células en 1.962 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante. Usando un 0.22 μm PVDF filtro filtro estéril el líquido celular decantados. Alícuota 1 mL del líquido celular estéril cultura en 1,5 mL tubos de Eppendorf para el análisis del título. Almacenar los tubos de 1 mL a-20 ° C. Purificar el resto del fluido de cultura celular cosechada mediante sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas. 6 4. medición de títulos de IgG Nota: Este es un somero Resumen de la ejecución y análisis de muestras usando el sistema biosensor de proteínas. Todos los parámetros del análisis ( p. ej. temperatura, tiempo de lectura, rpm, etc. ) debe ser determinado empíricamente para cada tipo de muestra. Encienda el sistema y deje que la lámpara se caliente para al menos eliminar las muestras h. 1 congelador para descongelar y alcancen la temperatura ambiente. En el software del sistema, establecer la temperatura de la placa y 26 ° C. Remojar previamente el número de consejos de la proteína para ser utilizado en la matriz de la muestra (por ejemplo medios de celular) para por lo menos 30 minutos.Nota: La temperatura óptima debe ser determinada empíricamente. Una temperatura de 26 ° C se utiliza aquí para minimizar la evaporación de la muestra durante el tiempo de análisis y que el instrumento mantener una temperatura constante (por estar varios grados por encima de la temperatura ambiente). Las muestras deben ser previamente equilibrada a la temperatura de ensayo solicitadas antes de la medición por incubar la placa de la muestra en el escenario de la muestra de ≥ 10 minutos. Construir una curva estándar de proteína utilizando el mismo anticuerpo concentrado 10 mg/ml y diluir en serie en la matriz de la muestra (es decir, los medios de comunicación) en el rango que debe ser detectado.Nota: Es importante obtener una alta concentración de anticuerpo para minimizar los efectos de la matriz debido a la dilución, pero también es importante no sobre concentrado de los anticuerpos e inducir agregación. Es preferible correr una curva estándar en placa para la placa de cada muestra. Como mínimo, un control positivo debe utilizarse para tener en cuenta la variabilidad de punta a punta y a la placa. Una curva estándar nuevo debe generarse para cada lote nuevo de proteína A puntas utilizan. Diseño de la placa de la muestra (por ejemplo, ver figura 2). En una proteína A ensayo que utiliza la regeneración, hasta 80 muestras puede ser analizada, que incluye muestras de cultura desconocida, estándares y controles. Para cada placa analizado, se utilizará una punta única proteína A medir hasta 10 muestras en la placa (columnas 1-10), con un ciclo de regeneración entre cada muestra.Nota: Se recomienda que toda la primera fila de la placa (columna A) se utiliza como referencia y control negativo. En el ensayo que comentamos aquí, filas B y C se utilizan para dos controles positivos; uno en la parte inferior y uno en el límite superior de la respuesta lineal. Esto asegura que cada Consejo medidas de controles positivos y negativos antes de analizar las muestras. Esta configuración simplifica también resta de referencia en el software de análisis. Los pozos restantes entonces se utilizan para muestras desconocidas. Si hay un espacio de muestra en una de las filas, debe haber una matriz en que bien para evitar la sequedad de la punta (es decir, A2 de pozos a través de G2 tiene muestra mientras que H2 no. Asegurar H2 contiene la matriz de la muestra para asegurar la punta no se deseque antes de proceder al H3 de la muestra). Por último, no de escape consejos mediante el uso de un sistema para analizar las placas múltiples. Se recomienda el uso de un nuevo, sistema no regenerado para cada plato. Preparar muestras para análisis, mezclando suavemente , ya sea por inversión o pipetear, seguidos de un exprimido de pulso para recolectar muestra en la parte inferior del tubo. Para las muestras de concentrado, crear repeticiones de dilución diluyendo en la matriz de la muestra.Nota: La gama linear de la Unión de un anticuerpo para la proteína A medidas de interferometría (BLI) bio-capa variará por los anticuerpos, las condiciones analíticas y matriz. Esto debe determinarse empíricamente previamente para garantizar que se utilizan diluciones de la muestra adecuado. Preparar las placas de 96 pocillos muestra tan cerca de tiempo de ensayo como sea posible. Asegurarse de que no queden burbujas de aire en cualquiera de los pozos de. Elimine las burbujas de aire con una pipeta limpia o por centrifugación. Placa de carga en el sistema y ejecute el ensayo utilizando el valor por defecto “Alto análisis de sensibilidad con regeneración” en el software de adquisición de datos. Analizar utilizando el software de análisis de datos de HT.Nota: Si las placas son para estar preparado antes de tiempo debido a las limitaciones, sellar bien con la película para evitar la evaporación. Dependiendo de los títulos esperados, tiempos y tarifas de adquisición deba ajustarse. Consulte el manual de orientación. Utilizando el software de análisis de datos, referencia reste y calcular la concentración de las muestras desconocidas usando la curva estándar y la función de la pendiente inicial (es) con un punto a punto linear fit.

Representative Results

Monitoreo de parámetros críticos de proceso y otros parámetros de la cultura de célula durante el funcionamiento de los cultivos celulares es un aspecto importante en bioprocesamiento. El contador de célula y analizador de nutrientes se utilizan para cuantificar cinco atributos que caracterizan el crecimiento celular, consumo de nutrientes y formación de subproducto. El recuento se obtuvieron todos los días para todas las condiciones de la cultura. Las densidades promedio células viables y viabilidades son como se ve en la figura 3 , junto con su intervalo de ±1 SD. También se muestran los perfiles de nutrientes y subproducto con el intervalo de ±1 SD a través de la fase estacionaria de las culturas. La pendiente de este perfil representa las tasas medias de glucosa y glutamina consumo y producción de lactato. En general, estos resultados demuestran la factibilidad de monitoreo estos atributos en el sistema de microbioreactor; así como la capacidad del sistema microbioreactor para mantener estos parámetros dentro de un rango ajustado. La productividad total de los cultivos celulares se cuantificó usando un sistema biosensor de proteínas después de que los medios de cultivo celular cosechada fue pasado a través de un filtro de 0,22 micras PVDF. La productividad específica por celular que oscilan de 0.87 pg/célula-d a 1.15 pg/célula-d como se ve en la figura 4. Basado en estos resultados se puede investigar una amplia gama de condiciones para seleccionar la composición de los medios de comunicación y alimentación estrategias que maximicen la cantidad de proteína producida por una inversión mínima en procedimientos experimentales. Figura 1 : Diseño del sistema de microbioreactor con 4 estaciones de la cultura (CS) con 12 recipientes de reactor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  Figura 2 : Ejemplo muestra placa set-up para una cuantificación básica con el experimento de regeneración en el sistema de biosensor proteínas. fila 1 (rojo “R”) es reservado para la muestra de referencia (es decir, matriz ausente analito); fila 2 (Aguamarina) es un conjunto de normas (concentraciones en μg/mL); filas 3 y 4 (naranja) son sistemas de bajos y altos los controles positivos (“PL” y “PH”, respectivamente); filas 5 a 10 (púrpura) contienen muestras desconocidas; filas 11 y 12 (gris) son posiciones de programa predeterminado para la regeneración (“R”) y buffer de neutralización (“N”). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  Figura 3 : una) promedio de perfiles de densidad y viabilidad de células viables sobre la edad de un lote. ± 1 SD también se muestra para indicar que el estricto control del crecimiento celular en los sistemas de microbioreactor. b) perfil nutriente promedio de glucosa y glutamina, así como el perfil promedio subproducto lactato. ± 1 SD también se muestra para indicar que un control estricto sobre la composición de los medios de comunicación en los sistemas de microbioreactor. (N = 3, todas las condiciones fueron funcionadas por triplicado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : Representante diagrama de caja de productividad media específica de las diferentes condiciones de los medios de comunicación. (N = 3, todas las condiciones fueron funcionadas por triplicado) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Discussion

Funcionamiento el sistema automatizado del biorreactor micro y eficiente consiste en la ejecución oportuna de múltiples pasos automatizados. Una de las partes más importantes del funcionamiento del sistema es el software de programación. Si hay algún error al escribir el programa, habrá graves errores en el experimento que puede resultar en cambios inesperados en el proceso, estrategia, estrategia de muestreo o calidad del producto final que puede invalidar los resultados del estudio de la alimentación. Otro aspecto importante del funcionamiento del sistema es Coloque y apriete correctamente la placa de la abrazadera para asegurar control adecuado de la. La indicación más común que la placa de fijación ha sido apretada irregularmente es variaciones inesperadas en las medidas de para los vasos 1, 6, 7 y 12 (esquina reactor de vasos). General inestabilidad indica un aflojamiento de las juntas de las líneas de entrada de gas en las placas de sujeción. Este escenario puede impedir alcanzar el set point de. Otra trampa común para evitar al comenzar un experimento es dejar que las células se sientan demasiado tiempo durante la etapa de inoculación, causando que resolver. Menos tiempo que las células pasan sentado, el menos posibilidades hay que progresivamente menor recuento del inóculo se agrega cronológicamente a los reactores que pueden inducir sesgos significativos que involuntariamente daña los resultados del estudio. Es mejor sembrar en etapas múltiples, es decir, inocular entre cada estación de la cultura uno con los pasos de pausa para que las células no están sentados en la placa de inoculación durante más de 15 minutos.

Sobre el uso día a día, mantener la esterilidad es vital. Aunque el sistema está en un gabinete de seguridad biológica, no se garantiza la esterilidad debido a frecuentes movimientos dentro y fuera de la campana. En consecuencia, todo lo que va en la campana debe ser rociado con IPA 70%. En segundo lugar, es esencial para asegurar que la formación mínima de espuma ocurre durante el cultivo; los medios de comunicación pueden atascar al gasear y agotar las líneas, resultando en daños de la placa de la abrazadera e incluso componentes abajo. Medidas preventivas además de espuma son fundamentales en cualquier diseño del biorreactor micro programa. En el caso de una espuma de”hacia fuera” sería beneficioso para seguir los fabricantes protocolo de limpieza y puede prevenir el daño permanente de las placas de sujeción. Como alternativa, uso de recipientes no sparged puede ser beneficioso para menores densidades celulares o cuando se ejecuta en modo por lotes, superficie más alta al cociente del volumen permite eficiente oxígeno incluso con la carencia de un sparger. Sin embargo, los buques no sparged no podrían ser útiles para culturas de célula alta densidad o de la perfusión como el espacio de cabeza no es suficiente para mantenerse al día con las culturas creciente consumo de oxígeno.

Hay numerosas ventajas proporcionadas por el sistema de microbioreactor, ya que permite que múltiples culturas controladas para ejecutarse en paralelo en pequeña escala con un mayor control de agitar los frascos. 17 por tanto, el sistema facilita la ejecución de estudios, hace estudios de clones de alto rendimiento y estudios de transfección de detección. Manejo automatizado de líquidos también reduce la variabilidad de Analista a Analista minimizando al mismo tiempo tediosa y mucho tiempo de trabajo para personal capacitado. Si bien hay varias ventajas al sistema, existen varias desventajas claves que deben considerarse. En primer lugar, un volumen de 15 mL de cultura limita significativamente en el proceso muestreo y material de cosecha final y varios Biorreactores alternativas a pequeña escala (hasta 500 mL) recientemente han estado disponibles. Un adelanto reciente al sistema es la integración del biorreactor automatizado microescala con el analizador del BioProfile FLEX 2 de Nova Biomedical, que mitiga el problema de proceso de muestreo en reduciendo el volumen de la muestra para el análisis de densidad y nutriente celular . Beneficios pueden incluir la configuración rápida y prácticamente sin limpieza hacia ahorros operacionales, sin embargo el costo de las unidades desechables debe ser considerado para proyectos de largo plazo que sea más costoso comprar las unidades que los sistemas convencionales reutilizables.

El método discutido en este trabajo es principalmente conveniente para el cultivo de células de modo por lotes, pero puede modificarse dependiendo de las necesidades del usuario. Cada estación tiene un control independiente de temperatura, mientras que DO y pH pueden variar en el nivel de reactores individuales. Sartorius ofrece también DoE software diseñado específicamente para permitir experimentos de planificación para ser adaptado para el sistema micro del biorreactor. Estudios de DoE de gran escala usando el nuevo software de DoE proporcionado por el fabricante pueden ayudar en los medios de comunicación y optimización de suplemento. Aunque no se utiliza aquí, el sistema microbioreactor permite también estudios batch alimentado. El sistema aún no ha sido optimizado para cultivos celulares de perfusión. Sin embargo, ha habido pocos estudios y ensayos para imitar la operación de cultivo de células de la perfusión en el actual sistema de biorreactor micro. 26 este método puede ser modificado para imitar culturas de perfusión de alta densidad por colocar la célula. Variando la altura a la que la pipeta se introduce en el reactor y optimizando el tiempo de adaptación, los medios de comunicación se pueden quitar y reponer a modo de profusión de espejo de la cultura. Hay nuevos productos en esta área en desarrollo que puede funcionar mejor que el sistema presentado aquí si se desea el modo de la perfusión de la cultura.

En Resumen, este estudio demuestra el uso de automatizado micro-biorreactores y asociados analítico para operaciones de cultivo de células CHO producir y caracterizar un anticuerpo IgG1 Monoclonal de modelo. Destaca el papel de micro-biorreactores de pequeña escala en la fabricación de bioprocesos y su impacto en el desarrollo de la cultura de célula y proyección de los medios de comunicación. Mientras que hay muchas ventajas a usar un sistema automatizado de pequeña escala, para obtener todos sus beneficios procesan de comprensión y caracterización analítica es imprescindible. Este estudio proporciona al usuario una guía para el uso de un sistema de reactor de microescala automatizado, que puede ser desarrollado y mejorado por las necesidades de investigación individual.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Scott Lute para el apoyo analítico que. Parcial de financiamiento interno y el apoyo a este trabajo fue proporcionado por el programa de ruta crítica de CDER (CA #1-13). Este proyecto fue apoyado en parte por una cita para el programa de participación de prácticas/investigación en la oficina de productos biotecnológicos, U.S. Food and Drug Administration, administrado por el Instituto Oak Ridge para la ciencia y la educación a través de un convenio interinstitucional entre el Departamento de energía de Estados Unidos y la FDA.

Materials

CHO DG44 Cell Line Invitrogen A1100001
ambr 15 automated microbioreactor system Sartorius 001-2804 automated micro bioreactor
ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged Sartorius 001-2B80
1 mL disposable pipette tips, sterilized Sartorius A-0040
5 mL disposable pipette tips, sterilized Sartorius A-0039
24 Well deep well plates Sartorius A-0038
1 Well plates Sartorius A-0068
Vi-Cell XR cell counter Beckman Coulter 731050 automated cell counter
EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) Sigma-Aldrich 59920C-1B
CD OptiCHO AGT Medium Thermo Fisher Scientific A1122205
200 mM L-glutamine Corning 25-005-CV
100X Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) Fisher Scientific PBV12-5
125 mL glass Spinner Flasks Corning Life Sciences Glass 4500-125
250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) Nalgene (Thermo Scientific) 376814
TC20 Automated Cell Counter BioRad Laboratories, Inc. 1450103
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154
10x PBS Corning 46-013-CM
BioProfile FLEX Analyzer Nova Biomedical 49418 Nutrient Analyzer
Octet Red 96 Pall FortéBio  99-0042 Protein A Biosensor
Protein A Dip and Read Biosensors Pall FortéBio  18-5010
Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black Greiner Bio-One 655209
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References

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Velugula-Yellela, S. R., Kohnhorst, C., Powers, D. N., Trunfio, N., Faustino, A., Angart, P., Berilla, E., Faison, T., Agarabi, C. Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells. J. Vis. Exp. (139), e58231, doi:10.3791/58231 (2018).
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