نظام ميكروبيوريكتور لإنتاج IgG1 النموذجي في الخلايا شو الآلي استخدام الفائق
Summary
ويرد بروتوكول مفصل للعملية المتزامنة 48 الثقافات الخلية موازية تحت ظروف متنوعة في نظام ميكروبيوريكتور. ويرد وصف عملية الثقافة الخلية والحصاد وتحليل عيار الأجسام المضادة اللاحقة.
Abstract
Microscale الآلي المفاعلات الحيوية (15 مل) يمكن أن تكون أداة مفيدة للمهندسين ثقافة الخلية. وهي تيسر التنفيذ المتزامن لمجموعة متنوعة من الظروف التجريبية مع التقليل من احتمال عملية التغير. وتشمل التطبيقات هذا النهج: استنساخ الفرز، تحولات درجة الحرارة ودرجة الحموضة، وتحسين وسائل الإعلام والملحق. وعلاوة على ذلك، وحدات مفاعل صغير تفضي إلى “تصميم تجارب” كبيرة، أن التحقيق في مجموعة واسعة من الظروف. وهذا ما يسمح عمليات المنبع إلى حد كبير الأمثل قبل الصعود حيث التجريب هو أضيق نطاقا بسبب الوقت والقيود الاقتصادية. وتوفر النظم مفاعل حيوي microscale الآلي مزايا مختلفة على مدى التقليدية صغيرة النطاق وحدات الثقافة الخلية، مثل قوارير اهتزاز أو قوارير زر الزيادة والنقصان. ومع ذلك، خلال نطاق تجريبي عملية التنمية كبيرة يجب الحرص لضمان أن تتحقق هذه المزايا. عند تشغيل بعناية، النظام يمكن تمكين أتمتة عالية المستوى، ويمكن برمجتها لتشغيل وزارة الطاقة مع عدد أكبر من المتغيرات ويمكن أن تقلل من وقت أخذ العينات عند دمجها مع محلل المغذيات أو عداد الخلايا. تكامل الأساليب البحثية المستمدة من الخبراء المقدمة هنا، مع تجارب مفاعل حيوي microscale الآلي الحالي يمكن التقليل من المخاطر الشائعة التي تعيق نتائج ذات مغزى. وفي الحالات القصوى، يمكن أن يؤدي الفشل في التقيد بالمبادئ المبينة هنا إلى تلف المعدات التي تتطلب إصلاحات مكلفة. وعلاوة على ذلك، قد نظم ميكروبيوريكتور وحدات الثقافة الصغيرة مما يجعل من الصعب وصف ظروف ثقافة الخلية. يقتصر عدد وكمية من العينات المأخوذة في عملية في الوضع الدفعي الثقافة كوحدات التشغيل لا يمكن أن تقل عن 10 مل. وسيناقش هذا الأسلوب مزايا وعيوب النظم مفاعل حيوي microscale.
Introduction
وأنتجت مونوكلونل (مابس) أولاً في خلايا هيبريدوما الماوس في عام 19751. ومنذ ذلك الحين، حدث زيادة في تطوير إنتاج البروتين المؤتلف إضفاء الطابع الإنساني على مابس للزيادة في فيفو سلامة وفعالية2،،من34. تستخدم معظم عمليات إنتاج البروتين المؤتلف خلايا مبيض الهمستر الصيني (شو) للسهولة التي التي يمكن تكييفها للمصل وسائل الإعلام الحرة، قدرتها على إنتاج البروتينات مع التعديلات بوستترانسلاشونال مماثلة إلى أن الإنسان الفطرية البروتين وهذه الاعتمادية كمضيف الخلايا5،6.
يتزايد الطلب تسليم المنتج أسرع، وعدد أكبر من السكان المريض مع الحفاظ على جودة. بالإضافة إلى الفوائد الاقتصادية، يتزايد مرجع الأمراض التي يعالجها مابس، الذي يشمل الآن أمراض المناعة الذاتية، ومضاعفات ما بعد زرع الأعضاء، والتهاب المفاصل، والسرطان7. متوسط الغلة لخطوط إنتاج ماب التجارية الحديثة هي عادة في حدود 5-6 غ/لتر ويستمر ارتفاع5. في جزء منه، وقد تحقق من خلال الهندسة خلية شو وفحص خط الإنتاج المحسنة باستخدام المفاعلات الحيوية الفائق8. بيد أن معظم الزيادات في إنتاج البروتين قد نسبت إلى عملية التحسينات، بما في ذلك التقدم في تحسين وسائل الإعلام، شروط ثقافة الخلية، وتعزيز التغذية استراتيجيات7،،من910. مكملات المغذيات ضروري ليس فقط لنمو الخلايا السليمة ولكن أيضا لإنتاج البروتين ذات جودة عالية الكفاءة. وعلاوة على ذلك، تتطلب الخلايا إضافة المقايسة، تقتضي التفاهم الإضافية لتغذية استراتيجية التحسين6،11من العناصر المغذية المحددة. وتشمل أساليب التحسين التقليدية معايرة عنصر الوسائط الفردية ووسائل الإعلام مع التصاميم خليط مزج. ومع ذلك، هذه الأساليب المركزة مضيعة للوقت، والعمل، وتنطوي على المخاطر المرتبطة بالخطأ البشري12،13.
دراسات تحسين الإعلام سابقا تعتمد على اهتزاز قوارير والمفاعلات الحيوية ل 1-2 التي قد تكون باهظة من حيث المواد الخام ورأس المال البشري. واستخدمت أيضا ميكروبلاتيس ولكن هذه الأساليب توفير قابلية محدودة. وعلاوة على ذلك، قد لا يزال يتطلب متعددة تدير مضيعة للوقت الذي يعرض تقلب دفعة لدفعة مما يحجب تقلب ككا بسبب تكوين وسائل الإعلام واستراتيجية التغذية14،،من1516. وهكذا، الحاجة لمفاعل حيوي المتوازي الفائق ومتسقة عالية نظم ظهرت17،18،،من1920.
مع حساب الهامة المرتبطة بتشغيل المفاعلات الحيوية التقليدية على نطاق مقاعد البدلاء (0.5-5 L)، ميكروبيوريكتورس توفر بدائل تخفيض التكلفة لتقييم الإنتاج بيولوجيا المتأتية من المخدرات. 21 مقاعد البدلاء-مقياس خزان آثار المفاعلات الحيوية يمكن الاعتماد عليها وتوفر البيانات الكثيفة عبر صفائف الحسية. نظم مراقبة التغذية المرتدة تسمح بسهولة الإشراف على العملية. بيد أن الجمعية، والمعايرة، والتنظيف، وتكاليف اليد العاملة، الركيزة التكاليف، ومتطلبات التعقيم مقاعد البدلاء-مقياس خزان آثار المفاعلات الحيوية مكلفة والعمالة المكثفة للعمل. اهتزاز قوارير ولوحات ميكروتيتير إزالة بعض التكاليف والعمل المشاكل المرتبطة بالمفاعلات الحيوية مقياس أكبر، ولكن هذه البدائل توفر سيطرة ضعيفة على معالجة الأوضاع وإنتاج بيانات ذات الكثافة السكانية المنخفضة، غالباً ما سوى نقطة النهاية القياسات. 22
وبدلاً من ذلك، تستخدم ميكروبيوريكتورس كمية صغيرة من عمل لتوفير نهج مقياس لأسفل خط الخلية والمراحل الأولى من عملية التنمية. يمكنك تقليل حجم التجارب ميكروبيوريكتور كثيرا تكلفة التشغيل من خلال انخفاض في استخدام السلطة والركيزة، والعمل، والفضاء والمرافق. 23 ميكروبيوريكتورس ومثل قوارير اهتزاز في ذلك فسهلة للتعامل معها بسبب صغر حجمها، ولكن يحتفظون بمزايا المفاعلات الحيوية التقليدية على نطاق مقاعد البدلاء من خلال سيطرتها على الإنترنت ردود فعل من درجة الحموضة، درجة الحرارة، حلت الأكسجين، وحمض/قاعدة الاستهلاك، فضلا عن إخراج البيانات في الوقت الحقيقي على معايير الجودة بما في ذلك إيقاف تكوين الغاز. يسمح ميكروبيوريكتور مقياس للقدرة على الفرز الفائق، التي يمكن أن تكون مفيدة في تطوير عملية الاختيار واستنساخ. 24
مفاعل حيوي Microscale متقدمة قد ثبت أن تكون أداة فعالة شو خلية ثقافة عملية توصيف والتنمية18. هنا، نظام ambr15 الآلي، يتألف من 48 ميكروبيوريكتورس في نفس الوقت، أظهرت أن تكون قابلة للمقارنة إلى الكلاسيكية أثارت المفاعلات دبابة في نطاق إعداد الدراسات، واستخدمت25 بطريقة مشابهة للأعمال السابقة التي الأمثل وسائل الإعلام تكوين خط خلية تشو-DG44 المنتجة لنموذج تشيميريك IgG16. آثار ظروف وسائل الإعلام المختلفة على النمو وعيار مقارنة، وتحليلها. هذه الورقة قدمت إرشادات عامة لتشغيل نظام ميكروبيوريكتور وتحليل عينات النفط الخام في وسائل الإعلام.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشغيل النظام الآلي مفاعل حيوي الصغير بشكل صحيح وكفاءة تشتمل على تنفيذ عدة خطوات الآلي في الوقت المناسب. هو واحد من أهم أجزاء من تشغيل النظام البرمجة البرمجيات. إذا كان هناك أي خطأ أثناء كتابة البرنامج، يكون هناك أخطاء جسيمة في التجربة التي قد تؤدي إلى تغييرات غير متوقعة في عملية تغذية استراتيجية، واستراتيجية أخذ العينات، أو نوعية المنتج النهائي الذي قد يؤدي إلى إبطال النتائج التي توصلت إليها الدراسة. جانب مهم آخر لتشغيل النظام هي وضع وتشديد لوحة المشبك بشكل صحيح لضمان سيطرته القيام به. الإشارة الأكثر شيوعاً بأنه قد تم تشديد لوحة المشبك متفاوت من اختلافات غير متوقعة في القياسات للسفن 1, 6 و 7 و 12 (الزاوية مفاعل السفن). وعموما عدم الاستقرار يشير إلى تخفيف حشيات في خطوط الغاز مدخل في لوحات المشبك. هذا السيناريو قد تعوق بلوغ نقطة مجموعة القيام به. شرك مشتركة أخرى لتجنب عند بدء تجربة هو ترك الخلايا الجلوس فترة طويلة جداً أثناء الخطوة التطعيم، مما أدى إلى تسوية. وقت أقل في الخلايا قضاء الجلوس، فرصة أقل هناك أن تضاف تدريجيا خفض عدد خلايا العدوى زمنياً بسفن المفاعل الذي يمكن أن يستحث تحيز كبير عن غير قصد أن يضر بنتائج الدراسة. ومن الأفضل لتطعيم في مراحل متعددة، أي تطعيم كل مركز من مراكز الثقافة الواحدة تلو الأخرى مع خطوات وقفه في ما بين ذلك الخلايا لا يجلسون في لوحة التطعيم لمدة أطول من 15 دقيقة.
فيما يتعلق بالاستخدام اليومي، الحفاظ على العقم أمر حيوي. على الرغم من أن هذا النظام في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء، لا يضمن العقم بسبب كثرة الحركة داخل وخارج غطاء محرك السيارة. ونتيجة لذلك، يجب رش كل شيء أن يذهب في هود مع أصد 70%. ثانيا، من الضروري لضمان حدوث رغوة الحد الأدنى خلال الثقافة؛ وسائل الإعلام يمكن أن تسد الغاز واستنفاد الخطوط، مما يؤدي إلى تلف لوحة المشبك وحتى المكونات الأساسية أدناه. الخطوات الوقائية المضادة الرغوة إضافة أمر حاسم في أي برنامج تصميم مفاعل حيوي الصغرى. في حالة “رغوة خارجاً” فإنه سيكون مفيداً لمتابعة الشركات المصنعة التنظيف البروتوكول ويمكن منع ضرر دائم من لوحات المشبك. وبدلاً من ذلك، قد تكون مفيدة لانخفاض كثافة الخلية أو استخدام السفن غير سبارجيد عند التشغيل في الوضع الدفعي كما يتيح سطح أعلى بنسبة حجم الأكسجين كفاءة حتى مع عدم سبارجير. ومع ذلك، سفن غير سبارجيد قد لا يكون مفيداً للثقافات الخلية عالية الكثافة أو نضح كمساحة الرأس غير كافية لمواكبة ثقافات تزايد استهلاك الأوكسجين.
وهناك العديد من المزايا التي يوفرها نظام ميكروبيوريكتور، كما أنها تمكن متعددة الثقافات التي تسيطر عليها ليتم تشغيلها في نفس الوقت على نطاق صغير مع تحكم أكبر مما يهز قوارير. 17 ولذلك، من النظام يسهل تنفيذ فحص الدراسات والدراسات تعداء، الدراسات استنساخ عالية الإنتاجية. معالجة السائل الآلي يقلل أيضا من محلل إلى محلل تقلب مع التقليل في نفس الوقت شاقة ومكثفة وقت العمل للموظفين المدربين. وبينما هناك العديد من المزايا للنظام، هناك بعض العيوب الرئيسية التي ينبغي النظر فيها. أولاً، يحد حجم 15 مل ثقافة بشكل كبير في عملية أخذ العينات ومواد الحصاد النهائي، والمفاعلات الحيوية البديلة صغيرة الحجم متعددة (يصل إلى 500 مل) أصبحت في الآونة الأخيرة المتوفرة. واحد النهوض الأخيرة للنظام هو دمج مفاعل حيوي microscale الآلي مع محلل بيوبروفيلي فليكس 2 من “نوفا الطبية”، مما يخفف من هذه المسألة في عملية أخذ العينات بتخفيض حجم العينة لتحليل المغذيات وكثافة الخلية . يمكن أن تتضمن فوائد الإعداد السريع وتقريبا لا يؤدي التنظيف إلى وفورات تشغيلية، ولكن ينبغي النظر تكلفة الوحدات المتاح لفترة طويلة الأجل المشاريع كما أنه قد يكون أكثر تكلفة لشراء الوحدات من النظم التقليدية القابلة لإعادة الاستخدام.
الطريقة التي نوقشت في هذه الورقة أساسا مناسباً لثقافة الخلية الوضع الدفعي، ولكن يمكن تعديلها تبعاً لاحتياجات المستخدم. كل مركز من مراكز الثقافة بمراقبة مستقلة لدرجة الحرارة، وحين القيام به، ودرجة الحموضة يمكن أن تختلف على مستوى السفن مفاعل الفردية. كما يقدم سارتوريوس دو تخطيط برامج مصممة خصيصا للسماح بتجارب تكون مصممة خصيصا لنظام مفاعل حيوي الصغرى. دراسات وزارة الطاقة واسعة النطاق باستخدام البرمجيات وزارة الطاقة الجديدة المقدمة من الشركة المصنعة يمكن أن تساعد في وسائل الإعلام والتحسين تكملة. على الرغم من عدم استخدامها هنا، يتيح النظام ميكروبيوريكتور أيضا دراسات تغذية–دفعة. لا بعد تحسين النظام للثقافات الخلية التروية. ومع ذلك، كانت هناك دراسات محدودة والمحاكمات لتقليد نضح خلية الثقافة العملية في النظام الحالي لمفاعل حيوي الصغرى. 26 يمكن تعديل هذا الأسلوب لتقليد الثقافات نضح عالية الكثافة بخلية تسوية. متفاوتة الارتفاع الذي يتم إدراج في بيبيت في المفاعل والاستفادة المثلى من الوقت تسوية، يمكن إزالة وسائط الإعلام وتغذية لوضع إسراف مرآة للثقافة. وهناك منتجات جديدة في هذه المنطقة النامية التي قد تعمل بشكل أفضل من نظام المقدمة هنا إذا كان المطلوب هو وضع التروية للثقافة.
وباختصار، هذه الدراسة يوضح استخدام الآلي الصغير-المفاعلات الحيوية والمرتبطة التحليلية لعمليات ثقافة الخلية تشو لإنتاج وتميز جسم IgG1 [مونوكلونل] نموذج. ويؤكد الدور الذي تؤديه المفاعلات الحيوية الدقيقة صغيرة الحجم في الصناعة البيولوجية وأثرها على تنمية ثقافة الخلية وفحص وسائل الإعلام. بينما هناك العديد من المزايا لاستخدام نظام الآلي صغيرة حجم، ندرك تماما فهم العملية فوائدها والوصف التحليلي أمر حتمي. وتوفر هذه الدراسة المستخدم مع مبادئ توجيهية لاستخدام نظام مفاعل microscale إليه، التي يمكن تطويرها وتحسين كل الاحتياجات البحثية الفردية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر لوت سكوت للدعم التحليلي وقدموا. تمويل جزئي الداخلية وتقديم الدعم لهذا العمل قدم البرنامج المسار الحرج CDER (CA #1-13). هذا المشروع كان تدعمها جزئيا في موعد “البرنامج مشاركة” البحث الداخلي في مكتب لمنتجات التكنولوجيا الحيوية والولايات المتحدة للأغذية والدواء، يديره معهد أوك ريدج للعلم والتعليم من خلال اتفاق مشترك بين الوكالات بين وزارة الطاقة الأمريكية وإدارة الأغذية والعقاقير.
Materials
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C., Hu, W. -. S. . Cell Culture Bioprocess Engineering. , 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R., Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. . The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. , 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -. H., Chu, I. M., Hwang, S. -. M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -. T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -. M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
