Utilisation du haut débit MICROBIOREACTEUR système automatisé pour la Production d’IgG1 de modèle dans les cellules CHO

1. semences forment Expansion Remarque : Ce protocole utilise 1 mL recombinant DG44 CHO cell les stocks qui ont été stockés à une densité de ~ 3 x 107 cellules/mL. Les dilutions et un calendrier pour les différentes lignées de cellules CHO varieront. Mesurer les courbes de croissance de la lignée cellulaire sera utilisé au préalable et ajuster en conséquence. Les cellules sont initialement décongelés en flacons agitateurs et transférés dans une fiole de spinner. Déterminer le nombre de flacons agitateurs et des flacons de spinner nécessaires pour l’expérience basée sur le nombre de microbioreactors qui seront exécutées et la cible, la densité de semis. Décongeler rapidement vial(s) stock de cellules CHO en l’immergeant dans un bain-marie à 37 ° C jusqu’à ce que seulement une petite tranche de restes de glace. Décontaminer l’extérieur de la cuvette à l’aide de la solution d’éthanol à 70 % et un tissu non pelucheux. Transférer dans une armoire de sécurité biologique. Remettre en suspension les cellules par doucement pipetage de haut en bas et de transférer 1 mL dans une fiole de shake ventilé stérile 125 mL contenant 29 mL de milieu pré chauffé additionné de 8 mM de L-glutamine et 1 x pénicilline/streptomycine.Remarque : Sauf indication contraire, le terme « médias » dans le présent protocole sera ensuite être défini en tant que média de OptiCHO. Lieu shake Deutsch dans un incubateur à 37 ° C et 8 % de CO2. Utiliser un agitateur orbital pour agiter les cellules à une vitesse de 130 tr/min. Surveiller la densité de cellules viables (VCD) chaque jour à l’aide d’une cellule automatique dispositif de comptage ou manuellement avec un hémocytomètre et le bleu trypan. Repiquage (dilué) les 72 heures suivant l’inoculation dans les supports neufs (préchauffer les médias à 37 ° C chaque fois qu’il convient d’ajouter aux cellules) de cellules telles que le volume final est 100 mL dans une fiole de cône d’hélice de 125 mL. Incuber les cultures spinner dans les mêmes conditions, utilisées pour les cultures fiole agitées à une vitesse de 70 tr/min.Remarque : Après repiquage, cellules doivent être à une densité de 0,7-1 x 106 cellules/mL. Veiller à ce que la densité finale n’est pas inférieur à 0,5 x 106 cellules/mL. Repiquage après 96 h si la densité des cellules cibles pour l’inoculation dans les filatures n’est pas joignable. Le troisième jour (un jour avant la préparation de l’inoculum), ajouter des éléments multimédias fraîches, préchauffé à spinner-Deutsch pour maintenir la viabilité ≥ 90 %. Ne pas dépasser le volume total de 125 mL. 6 2. fonctionnement du système de MICROBIOREACTEUR automatique Configuration requise : L’utilisateur doit avoir reçu la formation appropriée du fabricant et doit se familiariser avec la sécurité et des conditions de fonctionnement pour le système. L’initialisation et le raccordement au compteur de cellules Initialiser le système d’exploitation. Avant d’ouvrir le logiciel, assurez-vous que le compteur de cellules (voir Table des matières) est en cours d’exécution ainsi que les logiciels respectifs. Le compteur de cellules est intégré au système. Se connecter à la connexion à distance compteur cellulaire avant d’ouvrir le logiciel. Cliquez sur l’icône du bureau distant et cliquez sur « Se connecter ». Une fois que le Bureau à distance est connecté, ouvrez le logiciel compteur de cellules. Installer un nouveau réactif, vide le bleu trypan déchets et amorcer le système. Minimiser la connexion à distance et ouvrez le logiciel de micro bioréacteur utilisant une expérience existante comme modèle pour créer une nouvelle expérience. Nommer et enregistrer l’expérience. Assurez-vous que le compteur de cellules automatisées est connecté sous l’onglet État dans le logiciel. Le statut peut également être vérifié sur le logiciel compteur de cellules. Définition de plaques et chargement des naviresRemarque : veuillez vous référer à la Figure 1 pour orienter le chargement des consommables et réactifs sur les stations de la culture et des ponts. Les flasques devraient être stérilisés à l’autoclave sur une gravité cycle (utilisé pour les matériaux solides) à avant utilisation. Avant de commencer une course, définir les plaques utilisées lors de l’exécution dans l’article synoptique du logiciel. Nommez chaque plaque utilisée et désigner chaque assiette d’un pont sur la station piscicole de MICROBIOREACTEUR. Utiliser une plaque 24 puits pour charger les médias et sur la terrasse désignée de la station piscicole. Placez 1 mL et 4 mL embout cases situées dans les sections tel qu’indiqué dans la Figure 1. Posez une plaque 24 puits inoculation sur le pont respectif de la station piscicole. Placez le puits 1Ã tamponné phosphate salin (PBS) plaque sur le pont 1. Placer la plaque de NaOH 1 M puits sur le pont 2 et la plaque 24 puits antimousse sur le pont 7 (Positions comme il est indiqué dans la Figure 1). Les numéros de pont sont schématiquement indiquées sous l’onglet « Mimic » dans le logiciel. Déballez les récipients de culture (équipés d’AERATEURS) à l’intérieur de la hotte du cabinet de sécurité. Placer des récipients de culture stériles douze par la culture. Place autoclavés fixer les plaques sur le dessus des vaisseaux. Veiller à ce que les trous des insertions prévues les agitateurs de tous face à la même direction pour placement plus facile.Remarque : À l’aide d’un marqueur permanent, catégoriser les récipients de culture avant de les placer dans la station piscicole de gagner du temps et éviter toute confusion au moment de la récolte. Plaquette serre joints toriques sont la première partie de porter vers le bas après autoclavage répété, donc soigneusement Vérifiez-les avant l’autoclavage avant chaque expérience. Garder une plaque pince stérile comme back-up en cas de défaillance du joint torique est recommandé. Placer les plaques de remuer sur le dessus les flasques, assurant chaque broche est bien insérée. Fixez les plaques de serrage avec des vis et des boutons fournis. Serrez les boutons jusqu’à ce qu’ils sont serrés à la main. Serrer les boutons gauche et droite alternativement pour la même mise en place de la plaque de fixation.Remarque : Si l’attache n’est pas aligné contre la surface ou si les vis à l’extrémité de la plaque de fixation sont inégalement serrées, les vaisseaux connaîtra des problèmes de contrôle de l’oxygène dissous (DO). Si ces réglages ne corrigent pas le problème, vérifier les joints toriques comme fermeture incomplète des plaques peut conduire à un gazage inefficace de la culture. Exécutez le logiciel automatisé bioréacteur MicroRemarque : utilisation « Étapes » onglet pour modifier ou créer de nouvelles mesures. Il faut être programmés individuellement pour démarrer et arrêter un processus. Cliquez sur le bouton « Insérer une étape » sous l’onglet étapes de processus pour créer de nouvelles mesures ou double-cliquez sur une étape existante pour modifier cette étape. Les étapes du programme sont divisées en dix sections principales : démarrage, charge de médias, antimousse Addition, / pH Control, ajouts de fond de Base, Paused pH, Inoculation, globules de 5 X, 10 X nombre d’éléments, nutriment analyseur d’échantillonnage et Culture mise à l’arrêt. La durée d’exécution est généralement entre 7 à 9 jours lorsqu’il est exécutés en mode batch. Le système initialise et vérifie la présence des vaisseaux appropriés. Scanner le code-barres fourni avec les récipients de culture. Le même code à barres peut être appliqué pour les stations de culture avec le vide ou bateaux n’étant ne pas utilisés. Le système commencera avec le programme conçu après vérification contrôle, gazage et autres connexions.Remarque : L’utilisateur peut aller de l’avant avec le programme même si une erreur se produit, mais le faire au risque de l’utilisateur et si instance n’endommage pas le système et n’interrompt pas l’expérience. Par exemple, gazage peut être désactivée pour certains bateaux non affectés à l’expérimentation qui apparaîtra comme une erreur, mais peut être contournée. Démarrage et chargement des médias Premier jour établissant le système ou les médias jour de charge est désignée comme jour 0 du temps de la culture. En vertu de la section de démarrage, première pipette charge conseils, conseils fois 1 mL et 4 mL, comme programmé. S’il est déjà placé, cliquez sur continuer. Placer la plaque de support, solution PBS 1 X, NaOH 1 M, plaque antimousse, médias charge plaque et plaque l’inoculation dans les ponts désignés ou, s’il est déjà placé, appuyer sur continuer passer à l’étape suivante. Dans le cadre du protocole de démarrage, commencer le contrôle de la température et régler la température à 37 ° C. Allumez le brassage à 1000 tr/min et le DO / moniteur de pH. Ensuite, exécutez les médias Programme de charge. Le gestionnaire de liquid du système automatisé MICROBIOREACTEUR distribuera les médias de la plaque de support pour les récipients de culture comme mappé dans le programme. Les médias ajoutés sont OptiCHO avec différentes conditions de processus.Remarque : Deux puits d’une plaque 24 puits sont tenus de remplir un récipient de culture à capacité (13 mL), que chaque puits ne peut accueillir que 8 mL de médias. Utilisez 7 à 8 mL dans chaque puits pour empêcher l’air dessin lorsque le média est mixé par le gestionnaire liquid avant la charge. Une fois le support de charge est terminé, 35 µL d’antimousse Ex-cellule s’ajouteront de la plaque d’antimousse pour le récipient de culture. Attendre 30 minutes pour le milieu de culture à bien mélanger et l’optique / capteurs pH de s’hydrater.Remarque : Le même volume d’antimousse est ajouté par intermittence tout au long de la période de culture quand la mousse est détecté. 6 moussant est détecté visuellement et cuves de réacteur sont vérifiées chaque jour pour écumer. Antimousse est ajouté immédiatement lors de la détection. Le DO / contrôle du pH est alors allumé pour commencer la surveillance et l’enregistrement de l’et le pH du milieu de culture. Permettent du faire pour atteindre le point de consigne de 50 %, ce qui prend au moins 2 h. Après équilibration, allumez les ajouts base fond à atteindre un point de consigne pH de 7,1 pour tous les récipients de culture. Permettent et pH s’équilibrer pendant la nuit et de s’hydrater complètement. En pause pH – pH 1 jour Offset Le lendemain (marqué comme 1er jour), exécuter l’étape de pH en pause par lequel sélectionner culture navires sont analysées et un offset de correction du pH est déterminé.Remarque : Le nombre de navires de pH à échantillonner pour neutraliser le pH est utilisateur déterminé. Un échantillon de chaque cuve de réacteur n’est peut-être pas nécessaire si vous avez une bonne représentation de la population de bioréacteur. Placer les plaques de support de tube échantillon sur les ponts désignés et charge micro centrifugeuse tubes avec bouchons ouvert et situé à côté d’eux. Le gestionnaire liquid distribuera 600 µL du milieu de culture cellulaire dans le tube comme mappé dans le programme. Retirer immédiatement le pH d’échantillonnage et de mesure sur un bioanalyzer des éléments nutritifs qui a été étalonné correctement et pour lesquels le QCs ont été exécuté (voir ci-dessous, « Quotidienne Nutrient and Metabolite Analysis »).Remarque : Les échantillons sont gérés individuellement, immédiatement après le dessin, pour éviter les variations de pH en raison de l’exposition à l’air, comme le dégazage du CO2 à partir de l’échantillon peut provoquer des changements de pH. Appuyez sur « continuer » après chaque prélèvement, autrement que l’étape suivante ne sera pas exécuté. Entrez les valeurs de pH externe, dérivé de FLEX dans le logiciel, « compilation » automatiquement les offsets pour les navires échantillonnés. Manuellement les offsets obtenues pour les navires de l’échantillon en moyenne et entrez le numéro dans la colonne de décalage de pH utilisateur sous l’onglet « bateau ». Le décalage moyen puis s’appliqueraient à tous les navires. Permettre le pH s’équilibrer pendant au moins 2-3 heures, après quoi les récipients de culture peuvent être inoculés. Inoculation Après avoir mesuré les VCD, transférer le contenu de la casserole-Deutsch dans un stérile, 250 mL centrifuger conique tube et pellet cellules par centrifugation pendant 10 min à 140 g x à température ambiante. Décanter les vieux médias et remettre en suspension dans les médias assez fraîches telles que la densité finale doit être de 1 x 106 cellules/mL après avoir ajouté l’inoculum dans le récipient de culture. Ajouter les cellules en suspension dans le bien d’une plaque de 24 puits balconnet stérile désigné. Ajouter 3 mL d’inoculum dans chaque puits, dont 2 mL seront supprimé comme inoculum pour chaque récipient de culture. Placer la plaque de l’inoculum sur le pont désigné à l’intérieur de la hotte. Veillez à l’extérieur de la plaque de l’inoculum balconnet de pulvérisation avec de l’alcool 70 % avant de le placer à l’intérieur de la hotte. Comptage de cellules à l’aide automatique compteur de cellules Après l’inoculation, laissez les récipients de culture équilibrer pendant au moins une heure. Après une heure, exécuter le 5 X cell count étape dans le programme. 5 X indique le facteur de dilution utilisé pour lire le nombre d’éléments.Remarque : 5 nombre d’éléments de X est utilisé au départ lorsque les cellules sont dans la phase de latence. Lorsque les cellules atteignent leur phase exponentielle le 10 X le nombre de cellules sera utilisé. Basé sur l’échantillon et les volumes diluant l’instrument automatiquement représente le facteur de dilution et ajuste la valeur finale en conséquence. Le gestionnaire liquid ajoute d’abord 480 µL de solution 1 PBS X à la Coupe du compteur cellulaire suivie par l’ajout de 120 µL du milieu de culture cellulaire du récipient de culture. Le nombre d’éléments est alors lue en utilisant le compteur de cellules automatisées. Cette étape est répétée pour tous les navires. Le nombre d’éléments est la dernière étape pour le jour 1 de la période de culture. Avec les données et le pH, le nombre d’éléments données (densité de cellules viables et viabilité) sont également enregistrées quotidiennement par le logiciel.Remarque : Nettoyez la coupelle de compteur cellulaire au moins deux fois pendant la durée de la course avec 70 % d’isopropanol pour prévenir le colmatage des lignes. Lignes et cellules de circulation sont automatiquement nettoyés après chaque comptage cellulaire. En pause pH – pH jour 2 Offset Jour 2 du temps culturel, répétez l’étape « pH en pause » à l’aide de récipients de culture autre que celles qui ont été prélevées lors de l’étape initiale de pH en pause.Remarque : Échantillonnage de plus de la population de navire pour le pH en pause fournira un meilleur offset pour la correction du pH. Par conséquent, elles n’échantillonnent pas les même aux bateaux affectés aux pH suspendu depuis la veille. Aliment quotidien et analyse de métabolite Échantillons seront prises pour l’analyse des éléments nutritifs du jour 2 de la culture jusqu’à la fin de l’expérience et analysées à l’aide des éléments nutritifs bioanalyzer. Placer les plaques de support de tube échantillon sur les ponts désignés et charge micro centrifugeuse tubes avec bouchons ouvert et situé à côté d’eux. Le gestionnaire liquid distribuera le milieu de culture cellulaire dans le tube comme mappé dans le programme.Remarque : Pour le départ quelques jours (jours 2-4), la quantité d’échantillon pris dans le récipient de culture est 300 µL. C’est dilué avec 300 µL de PBS de X 1 délivrés par le gestionnaire de liquid. Ceci est fait pour conserver le volume de culture et d’éviter que le niveau de tomber au-dessous de 10 mL. En outre, les valeurs nutritives pour les premiers jours relèvent de la plage de détection instrument après dilution. Placer les échantillons dans le plateau de l’analyseur pour effectuer l’analyse des éléments nutritifs.Remarque : Congeler des échantillons qui ne seront pas analysés le jour même. Arrêt du système Pour terminer la course, tout d’abord désactiver le contrôle de température, suivi par l’agitation. En second lieu, arrêter le DO / ajouts de base de contrôle du pH et fond. En troisième lieu, arrêter tous les autres contrôles. Enfin, arrêter le moniteur système. Dévisser le collier et remuer les assiettes et retirer les récipients de culture. Nettoyer l’intérieur de la station piscicole avec un chiffon non pelucheux. Placer les plaques de séchage sur la station piscicole et vissez-les dans.Remarque : Cycle de séchage est requise pour la version refroidie du système et n’est pas nécessaire pour la version standard du système. Exécuter le cycle de séchage de 2 heures sur le programme. Nettoyer les plaques de serrage à l’aide de l’eau ultrapure suivie 70 % d’alcool isopropylique (IPA) pour évacuer le liquide condensé possible dans les lignes. Rincer avec de l’air pour enlever tout le liquide résiduel. Cliquez sur « Stop » dans le logiciel de bioréacteur une fois le cycle de séchage est terminée. 3. Culture cellulaire Transférer le liquide de culture de cellules des vaisseaux de réacteur et granules des cellules à 1 962 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Décanter le liquide surnageant. En utilisant un 0,22 µm PVDF filtre filtre stérile le milieu de culture cellulaire décantée. Aliquote 1 mL du milieu de culture de cellules stériles dans 1,5 mL Eppendorf tubes pour analyse de titre. Stocker les tubes de 1 mL à-20 ° C. Purifier le reste du milieu de culture de cellules récoltées à l’aide du système de chromatographie liquide de protéine rapide. 6 4. mesure IgG titres Remarque : Il s’agit d’un aperçu rapide de course et d’analyser les échantillons en utilisant le système de biocapteur proteinA. Tous les paramètres d’analyse ( p. ex. température, temps de lecture, tr/min, etc. ) doivent être déterminées empiriquement pour chaque type d’échantillon. Allumez le système et laisser la lampe se réchauffer pour les échantillons de supprimer au moins 1 h. du congélateur à décongeler et est proportionnelle à la température ambiante. Dans le logiciel système, régler la température de la plaque à 26 ° C. Pré-tremper le nombre de conseils de protéine A pour être utilisée dans la matrice de l’échantillon (par exemple les milieux cellulaires) au moins 30 minutes.Remarque : La température optimale doit être déterminée empiriquement. Une température de 26 ° C est utilisée ici pour minimiser l’évaporation d’échantillon pendant le temps d’analyse et de permettre à l’instrument maintenir une température constante (en étant plusieurs degrés au-dessus de la température ambiante). Les échantillons doivent être préalablement équilibré à la température d’essai choisi avant la mesure en incubant la plaque d’échantillon sur la scène de l’échantillon pour ≥ 10 minutes. Construire la courbe d’étalonnage de protéines en utilisant le même anticorps concentré à 10 mg/mL et diluer en série dans la matrice de l’échantillon (c.-à-d. médias) dans la gamme qui doit être détecté.Remarque : Il est important d’obtenir une forte concentration d’anticorps afin de minimiser les effets de matrice due à la dilution, mais il est également important de ne pas plus se concentrer l’anticorps et provoquer l’agrégation. Exécution d’une courbe d’étalonnage en plaque pour chaque plaque d’échantillon est préférable. Au minimum, un contrôle positif doit servir à rendre compte de la variabilité de la pointe-à-bout et la plaque à l’assiette. Une courbe d’étalonnage de nouveau doit être généré pour chaque nouveau lot de protéine une pointes utilisées. Conception de la plaque de l’échantillon (par exemple, s’il vous plaît voir la Figure 2). Dans une protéine A qui utilise la régénération, jusqu’à 80 échantillons peut être analysé, y compris les échantillons de culture inconnue, des normes et des contrôles. Pour chaque plaque analysée, une astuce simple protéine A servira à mesurer jusqu’à 10 échantillons de la plaque (colonnes 1 à 10), avec un cycle de régénération entre chaque échantillon.Remarque : Il est recommandé que la toute première ligne de la plaque (ligne A) servir de référence et le contrôle négatif. Dans l’essai discuté ici, lignes B et C sont utilisés pour les deux contrôles positifs ; un à la basse et l’autre à la limite supérieure de la réponse linéaire. Cela garantit que chaque pointe mesures témoins négatifs et positifs avant d’analyser les échantillons. Ce set-up simplifie également la soustraction de référence dans le logiciel d’analyse. Les puits restants sont ensuite utilisés pour les échantillons inconnus. S’il y a une lacune de l’échantillon dans l’une des lignes, il doit y avoir une matrice dans ce puits afin d’éviter le dessèchement de l’extrémité (c.-à-d. puits A2 par G2 ont échantillon n’est pas le cas de H2. Assurer H2 contient matrice de l’échantillon afin d’assurer la pointe se dessécher avant d’aller déguster H3). Enfin, n’épuisent pas de conseils à l’aide d’un set d’analyser plusieurs plaques. En utilisant un nouveau, non régénérés ensemble pour chaque plaque est recommandé. Préparer les échantillons pour analyse en mélangeant doucement , par inversion ou par pipetage, suivi d’un essorage impulsion pour recueillir l’échantillon au fond du tube. Pour les échantillons concentrés, créer réplicats de dilution appropriée par dilution dans la matrice de l’échantillon.Remarque : La gamme linéaire du binding pour un anticorps à la protéine une mesures d’interférométrie (BLI) bio-couche peut varier par l’anticorps, conditions expérimentales et matrice. Cela doit être déterminée empiriquement au préalable pour assurer les dilutions de l’échantillon appropriés sont utilisées. Préparez les plaques de 96 puits échantillon au plus près les temps de dosage possible. Il n’y a pas de bulles d’air dans l’un des puits. Enlever les bulles d’air avec une pointe de pipette propre ou par centrifugation. Plaque de charge dans le système et exécutez le test à l’aide de la valeur par défaut « Haute sensibilité dosage avec régénération » dans le logiciel d’Acquisition de données. Analyser à l’aide du logiciel d’analyse de données HT.Remarque : Si les plaques doivent être préparées en avance en raison de contraintes, sceller solidement avec le film pour empêcher l’évaporation. Selon les titres attendus, temps et taux d’acquisition peuvent devoir être ajustée. Consulter le manuel d’orientation. En utilisant le logiciel d’analyse de données, référence soustraire et calculer la concentration des échantillons inconnus à l’aide de la courbe d’étalonnage et de la fonction de la pente initiale (IS) avec un point à point linéaire s’adapter.