高スループットの自動モデル IgG1 CHO 細胞での生産のための Microbioreactor システム

1. 種子鉄道拡張 注:このプロトコルの密度で 1 mL 組換え DG44 町セル在庫を格納されているを使用して 〜 3 × 107セル/mL。希釈と個々 の町のセルラインのタイムラインは、異なります。事前に使用し、それに応じて調整する細胞株の成長曲線を測定します。セルは最初シェイク フラスコに解凍して、後でスピナー フラスコに転送。シェイク フラスコと実行されます microbioreactors と播種密度ターゲットの数に基づいて実験に必要なスピナー フラスコの数を決定します。 急速に氷のままほんのわずかだけまで 37 ° C の水浴に浸すことによって CHO 細胞のストックのバイアルを解凍します。70% エタノール溶液と糸くずのティッシュを使用して瓶の外側を消毒します。バイオ セーフティ キャビネットに転送します。 再優しく上下にピペッティングにより細胞を中断し、8 mM L グルタミンと補われる 29 mL に予め温めておいたメディアを含む 125 mL の滅菌出されたシェイク フラスコに 1 mL を転送ペニシリン/ストレプトマイシン x。注:特記されない場合は、このプロトコルでは「メディア」という用語は OptiCHO メディアとして定義以下。 場所は、37 ° C および 8% の CO2でインキュベーターで flask(s) を振る。130 rpm の速度で細胞を扇動するために軌道のシェーカーを使用します。 監視の実行可能な細胞密度 (VCD) デバイスを数える自動セルを使用して、毎日または手動で検定とトリパン ブルー色素。サブカルチャー (希薄) 細胞 (前 37 ° C にメディアをウォームするたびにセルを追加する必要があります) 新鮮なメディアでの接種後 72 時間最終巻が 125 mL スピナー フラスコ 100 mL になるようです。スピナー文化 70 rpm の速度でシェイク フラスコ培養に使用同じ条件で孵化させなさい。注:サブカルチャー後、細胞は 0.7 1 x 106セル/ml の密度でする必要があります。最終密度が 0.5 × 106セル/mL 以下ではないことを確認します。スピナーでの接種のターゲット細胞密度に到達できない場合に 96 時間後サブカルチャー。 3 日目 (接種準備の前日)、スピナーに新鮮な予め温めておいたメディアを追加-≥ 90% の生存率を維持するために flask(s)。125 mL の容量を超えないようにします。6 2. 自動 microbioreactor システムを実行しています。 前提条件:ユーザーは製造元から適切な訓練を受けている必要があり、安全性とシステムの動作の状況に精通している必要があります。 細胞カウンターへの接続の初期化と オペレーティング ソフトウェア システムを初期化します。ソフトウェアを開く前にセル カウンターは、それぞれのソフトウェアと一緒に (材料の表を参照) が実行されていることを確認します。細胞カウンターは、システムに統合されます。 ソフトウェアを開く前にセル カウンターのリモート接続に接続します。リモート デスクトップ アイコンをクリックし、「接続」をクリックしてくださいリモート デスクトップが接続されたら、携帯カウンター ソフトウェアを開きます。新しい試薬パック、空トリパン ブルーを無駄し、プライム システムをインストールします。 リモート接続を最小限に抑えるため、テンプレートとして既存の実験を使用して新しいテストを作成するマイクロ バイオリアクター ソフトウェアを開きます。実験に名前を付けて保存します。自動化された細胞カウンターがソフトウェアのステータス タブの下で接続されていることを確認します。細胞カウンターのソフトウェアの状態をチェックすることも。 プレートを定義して、血管を読み込み注:消耗品および文化局とデッキに試薬の読み込みの向きは、図 1を参照してください。クランプ プレートを使用する重力 (固体用) サイクル前にオートクレーブにする必要があります。 実行を開始する前に、ソフトウェアの模倣のセクションの実行中に使用されるプレートを定義します。各プレートの名前し、各 microbioreactor 文化ステーションにデッキ プレートを指定します。 24 ウェル プレートを使用して、メディアを充電するため、文化局の指定されたデッキに。場所 1 mL、4 mL ピペットの先端部は、図 1に示すようにセクションでボックスします。 文化局のそれぞれのデッキに接種 24 ウェル プレートを配置します。デッキ 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) プレート X 単一ウェル 1 を配置します。2 のデッキとデッキ 7 (位置図 1に示されているように) 24 ウェル消泡プレートに単一ウェル 1 M NaOH プレートを配置します。デッキ番号がダイアグラム ソフトウェアの「模倣」タブの下で表示されます。 安全キャビネット フード内側 (リングスパー ジャー装備) 培養容器を梱包から取り出します。文化駅あたり 12 滅菌培養容器を配置します。場所オートクレーブ船の上に板をクランプします。すべてのミキサーのインサートの穴が配置しやすく、同じ方向を向くことを確認します。注:永久的なマーカーを使用すると、時間を節約し、収穫時の混乱を避けるために文化の駅でそれらを配置する前に培養容器を分類します。 クランプ プレート O リングは、繰り返しオートクレーブ後消耗、従って慎重に各実験の前にオートクレーブに入れる前にチェックする最初の部分です。O リングの失敗した場合のバックアップとして滅菌クランプ プレートを維持することをお勧めします。 クランプ プレートの上に攪拌板を置き、安全に挿入されます各ピンを確保します。提供のノブ、ネジとクランプ プレートを固定します。まで、彼らはタイトな手は、ノブを締めます。また左右のノブを締めクランプ プレートの配置のため。注:クランプが表面に対してフラッシュされていないクランプ プレートの端にネジが均等にきつく締められる場合や、血管が溶存酸素 (DO) 制御の問題が発生します。これらの調整では問題が解決しない場合は、板の不完全なシールが文化の非能率的な毒ガス攻撃につながる可能性として O リングをチェックします。 自動マイクロ バイオリアクター ソフトウェアを実行します。注:使用「工程」タブを編集または新しい手順を作成します。手順は、個別に開始およびプロセスを停止するようにプログラムする必要があります。新しいステップを作成または既存のステップ、ステップを編集するをダブルクリックします。 プロセスの手順タブの下「ステップを挿入」ボタンをクリックしてします。プログラムのステップは 10 の主要なセクションに分かれています: メディア充電、起動系消泡剤添加、DO/pH コントロール、背景ベース追加、一時停止 pH、接種、5 X 細胞数、10 X 細胞数, 栄養アナライザーのサンプリングおよび文化駅シャット ダウン。実行の継続時間は、バッチ モードで実行するとき 7-9 日の間に通常です。 システムを初期化し、適切な血管の有無を確認します。培養容器に付属するバーコードをスキャンします。文化ステーション空の容器または容器の使用されていない、同じバーコードを適用できます。 システム設計プログラムは制御、ガス抜き、他の接続を確認した後開始されます。注:ユーザーは、エラーが発生したユーザーのリスクで進む進むシステムに害のないと実験に割り込まないかどうかこれを行う場合でも、プログラムを続行できます。たとえば、毒ガス攻撃可能性がありますオフに特定の血管のエラーとして表示されますが、無視することができます実験では使用されません。 起動とメディアの充電 システムまたは充電日メディアを最初の日の設定は、培養時間の 0 日として指定されます。 [スタートアップ] セクションで、最初の負荷ピペットのヒント、1 mL、4 mL のヒントとしてプログラムします。既に配置されている場合、続行するをクリックしています。指定されたデッキでメディア プレート、1 × PBS、1 M 水酸化ナトリウム、消泡板、メディア充電プレートと接種プレートを配置または、プレスが次のステップに移動し続ける既に配置されている場合。 起動プロトコルの一部として、温度制御を開始し、37 ° C に温度を設定1000 rpm で行う攪拌スイッチ/pH モニターします。 充電プログラム メディアを次に、実行します。自動 microbioreactor システムの液体ハンドラーは、プログラムで対応付けの培養容器に媒体の版からメディアを分配します。追加するメディアは、変化するプロセス条件 OptiCHO です。注:24 ウェルのプレートから 2 つの井戸は、各井戸のみ 8 mL の培地を収容できる容量 (13 mL) に 1 つの培養器を記入する必要。メディアは充電前に液体ハンドラーによって混合されているときに描画空気を防ぐために、各ウェルに 7-8 mL を使用します。 メディアの充電が完了すると、元セル系消泡剤の 35 μ L は、培養器に消泡板から追加されます。培地によく混合されると、光の 30 分を許可/pH センサーが水和する。注:断続的に発泡が検出された場合培養時間系消泡剤の同じボリュームが追加されます。6発泡が、視覚的に検出され、原子炉容器は発泡の毎日がチェックされます。系消泡剤が検出されるとすぐに追加されます。 DO/pH コントロール監視と記録を行うと培地の pH を開始に切り替えた。少なくとも 2 時間は、50% のセット ポイントに到達することを許可します。 平衡後背景基本追加すべての培養容器の 7.1 の pH 設定ポイントを達成するためにオンにします。行うと pH 一晩平衡し、完全に水和されるを許可します。 一時停止した pH – 日 1 pH オフセット 次の日 (日 1 としてマーク)、実行という選択文化船一時停止 pH ステップが分析され、pH 補正オフセットが決定されます。注:PH pH を相殺するためにサンプリングされる船の数は、ユーザーです。すべての原子炉からのサンプルは、バイオリアクター人口の良い表現があれば必要なできない場合があります。 指定されたデッキのサンプル チューブ ホルダー プレートを配置し、負荷マイクロ遠心チューブ キャップを開き、それらの横に隠れています。液体ハンドラーはプログラムで対応付けチューブに細胞培養液の 600 μ L を分配します。 すぐに削除するが正しくキャリブレーションされておりを QCs は (以下、「毎日の栄養と代謝物の分析」を参照) 実行されている栄養バイオアナライザーのサンプルおよび測定 pH。注:サンプルは、pH の変化を引き起こす可能性が CO2のサンプルからの脱気、空気への暴露による pH 変化を避けるために、描画した後すぐ、個別に実行されます。 「継続」をヒット後それぞれのサンプルをそれ以外の場合次の手順は実行されません。 サンプリング容器のオフセットを自動的に「コンパイル」ソフトウェアの外部、FLEX から派生した pH 値を入力します。手動でサンプル容器のオフセットを平均し、ユーザー pH「船データ」タブの下オフセットの列の下の番号を入力します。平均オフセットし全ての船舶に適用されます。少なくとも 2-3 時間、その後培養容器を接種することができますの平衡に pH を許可します。 接種 VCD を測定した後、スピナーの内容全体を転送-flask(s)、滅菌、250 mL の円錐形遠心チューブ、ペレットによる細胞へ室温で 140 x g で 10 分間遠心分離します。古いメディアを捨て、その最終的な密度は、菌を培養器に追加した後 1 x 106セル/mL をする必要があります十分な新鮮なメディアで再中断します。 浮遊細胞を無菌ふた 24 ウェル プレートの指定に追加します。うちの 2 mL を各培養器の感染源として削除されます、各ウェルに接種の 3 mL を追加します。 フード内の指定されたデッキに接種プレートを配置します。蓋接種プレートの外側を 70% アルコールでボンネット内に配置する前にスプレーしてください。 細胞数を使用して自動細胞計数 接種後少なくとも 1 時間の平衡培養容器をしましょう。時間後、プログラムで X のセル数ステップ 5 を実行します。5 X では、細胞数を読み取るために使用希釈倍率を示します。注:セルが遅れ位相で、5 X 細胞数は当初使用します。セルの指数のフェーズに到達した後、細胞数 × 10 が使用されます。サンプルや希釈ボリューム計測器は自動的に希釈倍率のアカウントし、最終的な値をそれに応じて調整されますに基づいています。 液体ハンドラーはまず培養器から細胞培養液の 120 μ l 加え、続いてセル カウンター カップに 1x PBS の 480 μ L を追加します。細胞数は自動化された細胞カウンターを使用して、読み取られます。この手順は、すべての船舶に対して繰り返されます。 細胞数は、培養時間の 1 日目の最後のステップです。細胞数と pH のデータと共にデータ (実行可能な細胞の密度と生存率) も記録されます毎日ソフトウェアによって。注:ラインの目詰まりを防ぐために 70 %ipa で実行の期間中に少なくとも二回細胞カウンター カップをきれいに。線と流体セルはすべてのセルのカウントの後自動的にクリーンアップします。 一時停止した pH – 日 2 pH オフセット 培養時間の 2 日、初期一時停止 pH 段階からサンプリングされたもの以外の培養容器を使用して「pH の休止」手順を繰り返します。注:一時停止した pH の容器の人口の多くをサンプリング、pH 補正の良いオフセットを提供します。したがって、前の日から一時停止した pH 用同じ血管をサンプリングしません。 毎日の栄養や代謝物分析 サンプル実験終了時まで 2 日目文化栄養分析のため撮影され、栄養バイオアナライザーを使用して分析します。 指定されたデッキのサンプル チューブ ホルダー プレートを配置し、負荷マイクロ遠心チューブ キャップを開き、それらの横に隠れています。液体ハンドラーは、プログラムで対応付けチューブに細胞培養液が調剤されます。注:最初の数日 (日 2-4) 文化容器から採取したサンプルの量は 300 μ L です。これは 300 μ L の液体ハンドラーによって調剤 1x PBS で希釈されています。これは文化ボリュームを節約し、レベルの 10 mL 以下のドロップを防ぐのためです。さらに、最初の数日間の栄養値は希釈後器械の検出範囲に収まります。 栄養分析を実行アナライザー トレイにサンプルを配置します。注:同じ日の分析はない任意のサンプルを凍結します。 システムのシャット ダウン 実行を終了、最初動揺続く温度制御オフにします。第二に、DO を停止/pH コントロールと背景ベースの追加。第三に、他のすべてのコントロールを停止します。最後に、システム モニターを停止します。 クランプをネジし、プレートを攪拌培養容器を削除します。-リントフリー文化局の内側をきれいに。文化ステーションの乾燥プレートを置きにそれらを台無しにします。注:乾燥周期システムの冷却のバージョンに必要なシステムの標準的なバージョンの必要はありません。 プログラムで 2 時間乾燥サイクルを実行します。きれいな純水を用いたクランプ板 70% イソプロピル アルコール (IPA) 行で可能な限り凝縮液を削除する後。任意の残留液体を除去する空気とフラッシュします。 バイオリアクター ソフトウェアを一度で「停止」をクリックして乾燥サイクルを終了しました。 3 細胞培養収穫 原子炉容器から細胞培養液を転送し、室温で 5 分間 1,962 x g で細胞のペレットします。 上清をデカントします。0.22 μ m PVDF フィルター滅菌フィルター デカントし細胞培養液を使用しています。 1.5 mL に無菌細胞培養液の分注 1 mL エッペン チューブ価分析のため。-20 ° C で 1 mL 管を格納します。タンパク質の高速液体クロマトグラフィーを用いた収穫された細胞培養液の残りの部分を浄化します。6 4. 測定 IgG 抗体 注:これは、実行と proteinA バイオ センサー システムを用いた試料の分析の大まかな概要です。すべてのアッセイのパラメーター (例えば温度、読み取り時、rpm、等) は、サンプルの種類ごとに経験的決定必要があります。 システムをオンにし、ランプを解凍し、室温に釣り合うに冷凍庫から少なくとも1 h. 削除サンプルのウォーム アップ。 システム ソフトウェアでプレート温度を 26 ° C に設定します。前 30 分に少なくともサンプル マトリックス (携帯メディアなど) で使用する蛋白質 A のヒントの数を浸しなさい。注:最適な温度は、経験的に決定する必要があります。26 ° C の温度はここで解析時間は長く中にサンプルの蒸発を最小限に抑え、(周囲温度数度であること) によって一貫性のある温度を保持するために楽器が許可されます。≥ のサンプル ステージ 10 分サンプル プレートをインキュベートしてで事前測定前に選ばれたアッセイ温度平衡なければサンプルする必要があります。 10 mg/mL に集中して同じ抗体を用いたタンパク質標準曲線を構築し、直列を検出できる必要がある範囲でサンプル マトリックス (すなわちメディア) で希釈します。注:高濃度、希釈のためのマトリックスの影響を最小限に抑えるための抗体を得ることが重要だもない以上抗体を集中し、凝集を誘導する重要です。各サンプル プレートのプレートに標準曲線を実行することをお勧めします。最小限、先端にチップとプレートの変動を考慮する肯定的なコントロールを使用する必要があります。ヒントが使用される蛋白質の各の新しい多くの生成、新しい標準カーブする必要があります。 サンプル プレートをデザイン (例については、図 2を参照)。タンパク質 A、未知の文化のサンプル、標準、およびコントロールを含む、最大 80 のサンプルの再生を使用してアッセイを分析できます。各プレートは分析の単一蛋白質チップはプレート (列 1-10)、各サンプル間に再生成サイクルの最大 10 個のサンプルを測定に使用されます。注:プレート (A 行) の最初の行全体がネガティブ コントロールと参照として使用することをお勧めします。ここで説明のアッセイで B と C の行を使用して、2 つの肯定的なコントロールの1 つの下で一度に 1 つ線形応答の上限。これにより、各チップのサンプルを分析する前に正と負のコントロールを測定します。この設定には、解析ソフトウェアで参照減算も簡略化されます。残りの井戸は、未知のサンプルの使用されます。先端の乾燥防止のためよくで行列する必要があります、行の 1 つのサンプルのギャップがある場合 (すなわち井戸 A2 G2 からサンプルを持っている H2 がないです。確実 H2 には先端が H3 をサンプルする前に、の乾燥しませんようにサンプル マトリックスが含まれています)。最後に、複数の板を分析する設定の 1 つを使用してヒントを排出しません。新しいを使用して、すべての板の非再生セットを推奨します。 ゆっくり混合することによって分析用サンプルを準備する、管の下部にサンプルを収集するためにパルス スピン反転またはピペットによって続きます。集中のサンプル、サンプル マトリックスで希釈することによって適切な希釈複製を作成します。注:タンパク質の抗体のバインドの線形範囲バイオ層干渉 (結合) 測定は抗体、アッセイ条件とマトリックスの両方によって異なります。これを決めておく経験的な適切なサンプルの希釈液を使用します。 測定時間をできるだけ近くに 96 ウェル サンプル プレートを準備します。井戸のいずれかの中に気泡がないことを確認します。きれいなピペット チップまたは遠心分離によっての空気の泡を削除します。 システムにプレートを読み込み、「再生と高い感度分析」データ集録ソフトウェアの既定の設定を使用して分析を実行します。HT データ解析ソフトウェアを使用して分析します。注:プレートを事前の制約のために準備する場合は、蒸発を防ぐためにフィルムを確実にシールします。期待される抗体によっては、集録速度や時間を調整する必要があります。マニュアルの説明を参照してください。 データ分析ソフトウェアを使用すると、参照は減算し、合う線形ポイント ツー ポイントと標準曲線と初期傾斜 (IS) 機能を使用して未知試料の濃度を計算します。