Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

1. semente treina expansão Nota: Este protocolo usa 1ml recombinante DG44 CHO célula estoques que foram armazenados em uma densidade de ~ 3 x 107 células/mL. Diluições e cronogramas para linhas de células CHO individuais irão variar. Medir as curvas de crescimento da linha de celular para ser usado antes e ajustar de acordo. As células são inicialmente descongeladas em agitar frascos e mais tarde transferidas para um balão de girador. Determine o número de agitar frascos e frascos de girador, necessários para o experimento com base no número de microbioreactors que serão executadas e o destino de densidade de semeadura. Descongele rapidamente conj estoque de células CHO por imersão em banho maria a 37 ° C até que apenas uma pequena lasca de restos de gelo. Descontaminar o exterior do frasco usando solução de etanol 70% e um tecido de fiapos. Transferir para uma armário de biossegurança. Ressuspender as células por suavemente pipetagem para cima e para baixo e transferir 1 mL para um balão de agitar exalada de 125ml estéril contendo mídia previamente aquecido de 29 mL suplementada com 8 mM L-glutamina e 1 x penicilina/estreptomicina.Nota: Salvo indicação em contrário, o termo “mídia” no presente protocolo será doravante definido como meios de OptiCHO. Lugar tremer flask(s) na incubadora mantida a 37 ° C e 8% de CO2. Utilize um agitador orbital para agitar as células a uma velocidade de 130 rpm. Monitorar a densidade de células viáveis (VCD) todos os dias usando uma célula automatizada contando o dispositivo ou manualmente com um hemocytometer e trypan azul. Subcultura (diluído) as células 72 horas após a inoculação em meios frescos (pré-aquecer a mídia a 37 ° C cada vez que ele deve ser adicionado às células) tal que o volume final é 100 mL num balão de girador de 125 mL. Incube as culturas girador na mesmas condições utilizadas para culturas de balão agitar a uma velocidade de 70 rpm.Nota: Após a repicagem, células devem ser em uma densidade de 0,7-1 x 106 células/mL. Certifique-se de que a densidade final não é abaixo de 0,5 x 106 células/mL. Subcultura após 96 h se a densidade de células alvo para inoculação em fiadores não pode ser alcançada. No terceiro dia (um dia antes da preparação do inóculo), adicionar mídia fresca, previamente aquecida a fiandeira-flask(s) para manter a viabilidade ≥ 90%. Não exceda o volume total de 125 mL. 6 2. executando o sistema automatizado de microbioreactor Pré-requisitos: Usuário deve ter recebido a formação adequada do fabricante e deve estar familiarizado com a segurança e condições de funcionamento do sistema. Inicializando e conectando-se ao balcão de célula Inicialize o sistema de software operacional. Antes de abrir o software, verifique se que o contador de célula (ver Tabela de materiais) está executando juntamente com o respectivo software. O contador de célula é integrado com o sistema. Conecte a conexão remota de célula contador antes de abrir o software. Clique no ícone da área de trabalho remoto e clique em “Connect”. Uma vez que a área de trabalho remota está conectada, abra o software do contador de célula. Instale um novo reagente pack, vazio o azul trypan resíduos e encha o sistema. Minimizar a conexão remota e abrir o software micro biorreator utilizando um experimento existente como um modelo para criar uma nova experiência. Nomeie e salve o experimento. Certifique-se de que o contador de célula automatizada é ligado sob a guia status no software. O status também pode ser verificado no software do contador da célula. Definindo as placas e os navios de cargaNota: por favor, consulte a Figura 1 para orientar o carregamento de consumíveis e reagentes sobre a cultura estações e plataformas. As placas de fixação devem ser esterilizadas em um antes de ciclo (usado para materiais sólidos) de gravidade de usar. Antes de iniciar uma corrida, define as placas utilizadas durante a execução na seção imitar do software. Nomeie cada placa utilizada e designar cada prato com um deck na estação de cultura microbioreactor. Usar uma placa de 24 para carregamento de mídia e coloque no chão designado da estação cultura. Coloque 1 mL e 4 mL ponta da pipeta caixas nas seções conforme indicado na Figura 1. Coloca uma placa de 24 poços inoculação no respectivo deck da estação cultura. Coloque o single-poço 1x tamponada fosfato salino (PBS) placa no deck 1. Coloque a chapa de NaOH 1 M single-bem no deck 2 e a placa antiespuma 24-bem no deck 7 (posições conforme indicado na Figura 1). Os números de convés são mostrados esquematicamente sob a aba “Imitar” no software. Descompacte os navios de cultura (equipados com sparger) dentro a capa do gabinete de segurança. Coloque doze navios de cultura estéreis por estação de cultura. Lugar autoclavado fixar as placas no topo dos vasos. Certifique-se de que os buracos em inserções previstas os agitadores todos enfrentam o mesmo sentido para uma colocação mais fácil.Nota: Usando um marcador permanente, categorize os vasos de cultura antes de colocá-los na estação cultura para economizar tempo e evitar confusões no momento da colheita. Chapa de fixação anéis são a primeira parte para desgastar após autoclavagem repetida, portanto, verificá-los cuidadosamente antes da autoclavagem antes de cada experimento. Manter um prato de pinça estéril como back-up em caso de falha do-Ring é recomendado. Colocar as placas celeuma em cima das placas de fixação, garantir cada pino firmemente inserido. Fixe as placas de fixação com os parafusos e os botões fornecidos. Aperte os botões até que eles são mão apertada. Aperte os botões esquerdos e direito Alternativamente para colocação até a chapa de fixação.Nota: Se a braçadeira não estiver rente à superfície ou se os parafusos na extremidade da placa de fixação são desigualmente apertados, os vasos vão experimentar problemas de controle de oxigênio dissolvido (DO). Se estes ajustes não corrigir o problema de fazer, verifique os O-rings como incompleta selagem de placas pode levar a ineficiente gaseamento de cultura. Executando o Software automatizado biorreator MicroNota: uso “Etapas do processo” guia para editar ou criar novos passos. Etapas precisam ser programado individualmente para iniciar e parar qualquer processo. Clique em “Inserir passo” sob a guia de etapas de processo para criar novos passos ou clique duas vezes em um passo existente para editar esse passo. As etapas do programa são divididas em dez seções principais: inicialização, carregamento de mídia, além de antiespumante, fazer / pH controle, adições de Base do fundo, pH pausado, inoculação, 5 X célula contagem de 10 X celular, amostragem de analisador de nutriente e cultura estação de desligamento. A duração de execução é geralmente entre 7-9 dias quando executados no modo em lotes. O sistema inicializa e verifica a presença dos navios apropriados. Digitalize o código de barras fornecido com os vasos de cultura. O mesmo código de barras pode ser aplicado para as estações de cultura com recipientes vazios ou navios não sendo usados. O sistema começará com o programa projetado após a verificação controle, gasificação e outras conexões.Nota: O usuário pode prosseguir com o programa, mesmo se um erro ocorre, mas fazê-lo em risco do usuário e se prosseguir para a frente não prejudique o sistema e não irá interromper a experiência. Por exemplo, envenenamento por gás pode ser desligado para certos navios não utilizados no experimento que vai aparecer como um erro, mas pode ser ignorado. Inicialização e carregamento de mídia O primeiro dia Configurando o sistema ou os meios de comunicação dia de carregamento é designado como dia 0 do tempo de cultura. Sob a seção de inicialização, primeira carga pipeta pontas, ambos 1 mL e 4 mL, conforme programado. Se já colocados, clique em continuar. Coloque a placa de mídia, 1X PBS, 1m NaOH, antiespumante placa, placa de carregamento de mídia e placa de inoculação em pavimentos designados ou, se já estiver colocado, pressione continuar mover para o próximo passo. Como parte do protocolo de inicialização, iniciar o controle de temperatura e temperatura de 37 ° C. Ligar a agitação a 1000 rpm e DO monitor de pH. Em seguida, execute a mídia programa de carregamento. O manipulador de líquido do sistema automatizado microbioreactor dispensará os meios de comunicação da placa de mídia para os vasos de cultura conforme mapeado no programa. A mídia adicionada é OptiCHO com diferentes condições de processo.Nota: Dois poços de uma placa de 24 são necessários para encher um navio de cultura para capacidade (13 mL), como cada poço só pode acomodar 8 mL de mídia. Use 7-8 mL em cada poço para evitar que o ar de desenho quando a mídia é ser misturada pelo manipulador de líquido antes do carregamento. Uma vez feito o carregamento de mídia, 35 µ l de antiespumante Ex-célula será adicionado da placa de antiespumante ao navio da cultura. Permitir que 30 minutos para o meio de cultura para ser bem misturado e a óptica DO / sensores de pH para ser hidratado.Nota: O mesmo volume de antiespumante é adicionado intermitentemente durante todo o tempo de cultura quando for detectada a formação de espuma. 6 Foaming é detectada visualmente, e os navios do reator são verificados todos os dias para a formação de espuma. Antiespuma é adicionada imediatamente em cima da deteção. DO / controle do pH é então ligado para iniciar o monitoramento e gravação do fazer e o pH do meio de cultura. Permitir que o fazem alcançar o ponto de ajuste de 50%, o que leva pelo menos 2 h. Depois equilibrio, ligue adições base de fundo para atingir um ponto de ajuste de pH de 7,1 para todos os navios de cultura. Permitem fazer e pH para equilibrar a noite e para ser completamente hidratado. Em pausa pH – pH 1 dia deslocamento No dia seguinte (marcado como dia 1), executar o passo de pH em pausa no qual selecione cultura vasos são analisados e um deslocamento de correção de pH é determinado.Nota: O número de navios de pH a amostrar para compensar o pH é usuário determinado. Uma amostra de cada embarcação de reator pode não ser necessária se você tem uma boa representação da população de biorreator. Coloque as placas de suporte do tubo de amostra em decks designados e carga centrífuga micro tubos com tampas aberta e dobrado ao lado deles. O manipulador de líquido dispensará 600 µ l de líquido de cultura a célula dentro do tubo conforme mapeado no programa. Remover imediatamente o pH da amostra e a medida em um bioanalyzer nutriente que tem sido devidamente calibrado e para os quais as QCs foram executados (veja abaixo, “Nutriente e metabólito análise diária”).Nota: As amostras são executadas individualmente, imediatamente após o desenho, para evitar alterações de pH, devido à exposição ao ar, como desgaseificação de CO2 da amostra pode causar mudanças de pH. Bateu o “continuar” depois de cada amostra, caso contrário, que o próximo passo não será executado. Insira os valores de pH externo, FLEX-derivado no software, “compilando” automaticamente os deslocamentos para os navios incluídos na amostra. Manualmente média os deslocamentos obtidos para os vasos de amostra e digite o número abaixo da coluna de deslocamento de pH usuário sob a guia “Dados de navio”. O deslocamento médio seria então aplicado a todos os navios. Permitir que o pH equilibrar pelo menos 2-3 horas, após o qual os vasos de cultura podem ser inoculados. Inoculação Após a medição VCD, transferir o conteúdo completo do girador-flask(s) em uma estéril, 250 mL centrifuga conico tubo e pelota células por centrifugação por 10min a 140 x g, à temperatura ambiente. Decantar a velha mídia e re-suspender em mídia bastante fresca, tal que a densidade final deve ser 1 x 106 células/mL após a adição do inóculo para o navio de cultura. Adicione as suspensão de células para o bem de uma placa estéril de tampa 24 designado. Adicione 3 mL de inóculo para cada poço, dos quais 2 mL será removido como inóculo para cada navio de cultura. Coloque a placa de inóculo no convés designado dentro do capô. Certifique-se de spray fora da placa de inóculo extraível com álcool 70% antes de colocá-lo dentro do capô. Contagem de células usando automatizado Cell Counter Após a inoculação, deixe os vasos de cultura equilibrar pelo menos uma hora. Depois de uma hora, execute o 5 X passo de contagem de células no programa. 5 X indica o fator de diluição usado para ler a contagem de células.Nota: contagem de células X 5 é usado inicialmente quando as células estão em fase de retardação. Depois as células alcançar sua fase exponencial será usado como o 10 X contagem de células. Com base na amostra e volumes de diluente o instrumento automaticamente contas para o fator de diluição e ajusta o valor final. O manipulador de líquido primeiro adiciona 480 µ l de 1X PBS para a Copa do contador de célula seguida pela adição de 120 µ l de líquido de cultura da célula do vaso cultura. A contagem de células é então lido usando o contador de célula automatizada. Essa etapa é repetida para todos os navios. A contagem de células é o último passo para o dia 1, o tempo de cultura. Juntamente com os dados DO e pH a contagem de células dados (densidade de células viáveis e viabilidade) também são registrados diariamente pelo software.Nota: Limpe Copa do contador de célula, pelo menos duas vezes durante a duração do percurso com IPA de 70% para evitar o entupimento das linhas. Linhas e células de fluxo são limpos automaticamente após cada contagem de células. Em pausa pH – pH dia 2 deslocamento No dia 2 do tempo de cultura, repita a etapa “Pausado pH” usando vasos de cultura diferente daqueles que foram amostrados de durante a etapa inicial de pH em pausa.Nota: Amostragem da população de navio para pH em pausa mais fornecerá um melhor deslocamento para correção de pH. Portanto, não amostra as mesma às embarcações utilizadas para pH em pausa do dia anterior. Nutriente diário e análise de metabólito Amostras serão levadas para análise de nutrientes do dia 2 de cultura até o final do experimento e analisados utilizando nutriente bioanalyzer. Coloque as placas de suporte do tubo de amostra em decks designados e carga centrífuga micro tubos com tampas aberta e dobrado ao lado deles. O manipulador de líquido dispensará o fluido de cultura de células dentro do tubo conforme mapeado no programa.Nota: Para a inicial alguns dias (2 a 4 dias) a quantidade de amostra colhida a partir do navio de cultura é 300 µ l. Esta é diluída com 300 µ l de 1X PBS dispensado pelo manipulador de líquido. Isso é feito para conservar o volume de cultura e impedir que o nível cair abaixo de 10 mL. Além disso, valores de nutrientes para os primeiros dias abrangidos pela faixa de deteção de instrumento após a diluição. Coloca as amostras no tabuleiro do analisador para realizar a análise de nutrientes.Nota: Congele a colheita de amostras que não será analisada no mesmo dia. Desligamento do sistema Para finalizar a execução, primeiro desligue o controle de temperatura, seguido pela agitação. Em segundo lugar, parar DO / controle do pH e fundo base adições. Em terceiro lugar, pare todos os outros controles. Por último, pare o monitor do sistema. Desaperte a braçadeira e agitar as placas e remover os navios de cultura. Limpe o interior da estação cultura com uma limpeza de fiapos. Colocar as placas de secagem na estação cultura e aperte-os em.Nota: Ciclo de secagem é necessário para a versão de refrigeração do sistema e não é necessário para a versão padrão do sistema. Execute o ciclo de secagem de 2 horas sobre o programa. Limpe as placas de fixação usando água ultrapura seguiram por 70% álcool isopropílico (IPA) para remover o líquido condensado possível nas linhas. Irrigue com ar para remover qualquer líquido residual. Clique em “Stop” no software do biorreator, uma vez que o ciclo de secagem terminou. 3. colheita de cultura de célula Transferir o líquido de cultura de células dos vasos reator e pelota células em 1.962 x g durante 5 min. à temperatura ambiente. Decante o sobrenadante. Usando um 0,22 µm PVDF filtro estéril filtro do fluido de cultura celular decantados. Alíquota de 1ml de líquido de cultura a célula estéril em 1,5 mL de tubos de Eppendorf para análise de título. Armazenar os tubos de 1ml a-20 ° C. Purifica o resto do fluido cultura celular colhido usando sistema de cromatografia líquida de proteína rápida. 6 4. medição IgG títulos Nota: Esta é uma visão superficial da execução e analisar amostras utilizando o sistema de biosensor de proteinA. Todos do ensaio parâmetros ( por exemplo, temperatura, tempo de leitura, rpm, etc. ) deve ser determinado empiricamente para cada tipo de amostra. Ligue o sistema e deixar a lâmpada aquecer para amostras de remover pelo menos 1 h. do congelador para descongelar e equilibrar a temperatura ambiente. No software do sistema, definir a temperatura da placa de 26 ° C. Pre-embeba o número de pontas de proteína A para ser usado na matriz da amostra (por exemplo, mídia de célula) pelo menos 30 minutos.Nota: A temperatura ideal deve ser determinada empiricamente. Uma temperatura de 26 ° C é usada aqui para minimizar a evaporação da amostra durante os tempos de análise mais e permitir que o instrumento manter uma temperatura consistente (por ser vários graus acima da temperatura ambiente). As amostras devem ser previamente equilibrada à temperatura de ensaio escolhido antes da medição incubando a placa da amostra na fase de amostra para ≥ 10 minutos. Construir uma curva padrão de proteínas utilizando o mesmo anticorpo concentrado para 10 mg/mL e diluir em série na matriz da amostra (ou seja, mídia) no intervalo que precisa ser detectado.Nota: É importante obter uma alta concentração de anticorpo para minimizar os efeitos de matriz devido a diluição, mas também é importante não mais concentrar-se os anticorpos e induzir a agregação. Executar uma curva padrão na placa para cada placa de amostra é preferível. Minimamente, um controle positivo deve ser usado para contabilizar a variabilidade de ponta-a-ponta e placa-to-plate. Uma nova curva padrão deve ser gerado para cada novo lote de proteína uma dicas usado. Desenha a placa da amostra (por exemplo, veja Figura 2). Em uma proteína de um ensaio que usa regeneração, até 80 amostras pode ser analisado, que inclui amostras de cultura desconhecida, padrões e controles. Para cada prato analisado, uma dica única proteína A será usada para medir até 10 amostras através da placa (colunas 1-10), com um ciclo de regeneração entre cada amostra.Nota: É recomendável que toda a primeira linha da placa (linha A) ser usado como referência e controle negativo. No ensaio aqui discutido, linhas B e C são usadas para dois controles positivos; uma para a parte inferior e uma no limite superior da resposta linear. Isso garante que cada ponta mede controles positivos e negativos antes de analisar as amostras. Esta configuração também simplifica a subtração de referência do software de análise. Os poços restantes são então utilizados para amostras desconhecidas. Se existir uma lacuna de amostra em uma das linhas, deve haver uma matriz naquele poço para impedir a secagem da ponta (ou seja, A2 de poços através da G2 tem amostra enquanto H2 não. Certifique-se de H2 contém a matriz de amostra para assegurar-se de ponta não secar antes de continuar a amostra H3). Por último, não esgotam dicas usando um conjunto para analisar várias placas. Utilizando um novo, recomenda-se não-regenerado conjunto para cada placa. Preparar amostras para análise, misturando delicadamente , por inversão ou pipetagem, seguido por uma rotação de pulso para coletar a amostra no fundo do tubo. Para amostras de concentrado, crie réplicas de diluição adequada diluindo na matriz da amostra.Nota: O intervalo linear de ligação de um anticorpo para uma proteína de medições de interferometria (BLI) um bio-camada variam por ambos os anticorpos, as condições de ensaio e matriz. Isto deve ser determinado empiricamente antecipadamente para garantir as diluições de amostras adequadas são usadas. Prepare-se placas de 96 poços amostra mais perto da hora de ensaio quanto possível. Assegurar que há nenhuma bolha de ar em qualquer um dos poços. Remova as bolhas de ar com uma ponta de pipeta limpa ou por centrifugação. Carregar a placa no sistema e executar o ensaio usando o padrão “Alta sensibilidade do ensaio com regeneração”, o software de aquisição de dados. Analise usando software de análise de dados de HT.Nota: Se as placas são para ser preparado antes do tempo devido a restrições, foca firmemente com filme para evitar a evaporação. Dependendo da concentração esperada, vezes e taxas de aquisição podem precisar de ser ajustados. Consulte o manual de orientação. Usando o software de análise de dados, referência subtrair e calcular a concentração das amostras desconhecidas usando a curva padrão e função de inclinação inicial (IS) com uma linear ponto a ponto se encaixam.