השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו
Summary
פרוטוקול מפורט עבור הפעולה בו-זמניות של תרביות תאים מקבילים 48 בתנאים מגוונים במערכת microbioreactor מוצג. תהליך התרבות תאים, קציר וניתוח כייל נוגדנים הבאים מתוארים.
Abstract
Microscale אוטומטיות ריאקטורים (15 מ ל) יכול להיות כלי שימושי עבור מהנדסים תרבות התא. הם מאפשרים ביצוע בו זמנית מגוון רחב של תנאי הניסוי תוך מזעור פוטנציאלי תהליך השתנות. יישומים של גישה זו כוללים: שיבוט ההקרנה, משמרות טמפרטורה, pH, מיטוב התקשורת והן את התוספת. יתר על כן, אמצעי האחסון כור קטן הם תורמת גדולה לעיצוב של ניסוי לחקור מגוון רחב של מצבים. זה מאפשר תהליכים במעלה שיש למטב באופן משמעותי לפני הסולם שבו ניסויים יותר מוגבל בהיקפו בשל אילוצים כלכליים וזמן. Microscale אוטומטיות ביוריאקטור מערכות מציעים יתרונות שונים מעל מידה קטן מסורתי תא תרבות יחידות, כגון טלטול מבחנות או טווה מבחנות. עם זאת, במהלך טייס סולם תהליך פיתוח משמעותי יש לנקוט כדי להבטיח כי יתרונות אלה הם הבינו. בעת הפעלה עם טיפול, המערכת יכול לאפשר אוטומציה ברמה גבוהה, ניתן לתכנת להפעיל של DOE עם מספר גבוה יותר של משתנים, יכולים לקצר את משך דגימת כאשר משולב עם מנתח מזין או תא מונה. שילוב של אלגוריתמים נגזר מומחה המובאים כאן, עם ניסויים ביוריאקטור microscale האוטומטי הנוכחית באפשרותך למזער מלכודות נפוצות המעכבים תוצאות משמעותיות. בצורה קיצונית, כישלון לדבוק העקרונות המפורטים כאן יכול לגרום נזק ציוד הדורש תיקונים יקרים. יתר על כן, המערכות microbioreactor יש תרבות קטנים כרכים מקשה על אפיון תנאים התרבות התא. המספר ואת כמות דגימות שנלקחו בתהליך אצווה מצב התרבות מוגבל כמו אמצעי ההפעלה לא נופלים מתחת 10 מ”ל. שיטה זו ידונו היתרונות והחסרונות של מערכות ביוריאקטור microscale.
Introduction
נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) יוצרו לראשונה בתאים עכבר-ליפידים-19751. מאז, עלייה בהתפתחות של ייצור חלבון רקומביננטי התרחש לאינוש mAbs עלייה ויוו בטיחות, יעילות-2,–3,–4. רוב תהליכי הייצור חלבון רקומביננטי להעסיק השחלה אוגר סיני (CHO) תאים עבור הקלות שבה הם ניתן להתאים מדיה פנויה סרום, וביכולתם לייצר חלבונים עם שינויים post-translational דומה לזה של אדם מולדת חלבון והאמינות שלהם בתור המארח תאים5,6.
הביקוש גדל כדי לספק את המוצר, ויותר לאוכלוסיות המטופל גדול יותר עם איכות עקבית. בנוסף ליתרונות הכלכליים, הרפרטואר של מחלות שטופלו על ידי mAbs גוברת, עכשיו כולל מחלות אוטואימוניות, סיבוכים שלאחר ההשתלה, דלקת פרקים, סרטן7. היבול הממוצע עבור קווי ייצור מודרניים mAb מסחרי בדרך כלל בטווח של 5-6 g/L, ימשיכו לעלות5. זה הושג דרך הנדסה תא צ’ו, קו הייצור של שיפור ההקרנה משתמש בתפוקה גבוהה ריאקטורים8. עם זאת, רוב העלאות ייצור החלבון יוחסו לעבד שיפורים, כולל החידושים בקידום אתרים במדיה, תנאי התרבות תאים, משופרת האכלה אסטרטגיות7,9,10. תוספי מזון חיוני לא רק לצמיחה התא הנכון אלא גם לייצור חלבון איכותי ויעיל. יתר על כן, תאים דורשים תוספת stoichiometric של חומרים מזינים מסוימים, הדורשים הבנה נוספת האכלה אסטרטגיה ואופטימיזציה6,11. שיטות אופטימיזציה המסורתית כוללים טיטור רכיב המדיה האינדיבידואליים ומדיה מיזוג עם תערובת עיצובים. עם זאת, שיטות אלה הן זמן רב, עבודה אינטנסיבית, כרוכים סיכונים הקשורים טעות אנוש12,13.
לימודי התקשורת אופטימיזציה בעבר התבססה על שייק מבחנות, ריאקטורים 1-2 L אשר עשוי להיות יקר מדי מבחינת חומרי גלם והון אנושי. Microplates גם שימשו אך בשיטות אלה מספקים מדרגיות מוגבלת. יתר על כן, זה עדיין עשוי לדרוש מרובים פועל זמן רב להציג השתנות אצווה-כדי-אצווה אשר מטשטש ההשתנות CQA הנגרמת על ידי מדיה קומפוזיציה האכלה אסטרטגיה14,15,16. לכן, הצורך ביוריאקטור מקביל בתפוקה גבוהה ועקבית מאוד מערכות המתגלים17,18,19,20.
עם ההוצאה משמעותיים הקשורים עם המבצע של ספסל מסורתי-סולם ריאקטורים (0.5-5 L), microbioreactors מציעים חלופה בהפחתת עלויות עבור הערכת הייצור ביולוגית נגזר סמים. ריאקטורים מנוער-טאנק 21 ספסל בקנה מידה מהימן ומספקים צפופה נתונים באמצעות מערכי חושית. מערכות בקרת משוב לאפשר פיקוח קל של המבצע. עם זאת, ההרכבה, כיול, ניקוי, עלויות העבודה, עלויות המצע ודרישות עיקור להפוך ספסל-סולם מנוער-טאנק ריאקטורים יקר, עבודה אינטנסיבית כדי לפעול. טלטול מבחנות וצלחות microtiter להסיר חלק העלות, עבודה בעיות הקשורות ריאקטורים בקנה מידה גדול יותר, אך חלופות אלה לספק שליטה חלש על תנאי עיבוד ולייצר נתונים בצפיפות נמוכה, לעתים קרובות רק מובילים מדידות. 22
לחלופין, microbioreactors לנצל את אמצעי העבודה קטן כדי לספק הגישה של סולם-מטה שורת התאים והתפתחות תהליך במעלה הזרם. קנה המידה של ניסויים microbioreactor יכול להפחית באופן משמעותי פועל עלות נמוכה יותר ניצול של כוח, המצע, דיני עבודה, שטח, עזרי. 23 Microbioreactors הם כמו צלוחיות לנער כי הם קל לטפל עקב גודלם, אבל הם שומרים את היתרונות של ספסל מסורתי-סולם ריאקטורים באמצעות שליטתם משוב מקוון של pH, טמפרטורה, התפרקה חמצן, ועל בסיס/חומצה צריכת, כמו גם שלהם פלט נתונים בזמן אמת של מדדי איכות כולל את ההרכב גז. Microbioreactor סולם מאפשר יכולת הקרנה תפוקה גבוהה, אשר יכול להיות שימושי עבור שכפול הבחירה ותהליך הפיתוח. 24
ביוריאקטור Microscale מתקדם הוכח להיות כלי יעיל עבור צ’ו תא תרבות בתהליך אפיון, פיתוח18. במסמך זה, מערכת אוטומטית ambr15, המורכבת microbioreactors 48 במקביל, אשר הוכחו להיות דומים במהירותם קלאסי מעורבב טנק כורים בקנה מידה על מחקרים,25 רגיל באופן מקביל עבודה מוקדמת ממוטבת התקשורת ההרכב עבור צ’ו-DG44 תא קו ייצור דגם IgG1 chimeric6. השפעת משתנים התנאים מדיה על הצמיחה, כייל נוגדנים היו יחסית, מנותח. נייר זה הוצג קו מנחה כללי כדי להפעיל את מערכת microbioreactor וניתוח של דוגמיות גולמי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפעלת מערכת ממוכנת ביוריאקטור מיקרו כראוי, ביעילות כרוך בזמן ביצוע מרובי שלבים אוטומטיים. אחד החלקים החשובים ביותר של הפעלת המערכת הוא תכנות בתוכנה. אם יש שגיאות בעת כתיבת התוכנית, יהיו שגיאות חמורות לניסוי שעלולים לגרום לשינויים לא צפויים בתהליך, האכלה אסטרטגיה, דגימה אסטרטגיה או איכות המוצר הסופי, אשר עלול לפסול את הממצאים של המחקר. היבט חשוב נוסף של הפעלת המערכת היא מקום והדק את הצלחת קלאמפ כראוי כדי להבטיח שליטה לעשות. הסימן השכיח ביותר הצלחת קלאמפ הודקה לצר הוא לא צפוי בווריאציות לעשות מדידות עבור כלי 1, 6, 7 ו- 12 (פינת הכור כלי). בסך הכל עושה יציבות מציין להתרופפות אטמים על הקווים כניסת הגז לוחית קלאמפ. תרחיש זה עלול להכשיל מגיעים לנקודה סט לעשות. כנחותים נפוץ אחר כדי להימנע בעת מתחילה ניסוי נותן את התאים לשבת זמן רב מדי במהלך השלב חיסון, גורם להם להתיישב. פחות מבלה התאים ישיבה, פחות סיכויים יש כי בהדרגה התחתון inoculum תא ספירת מתווספים באופן כרונולוגי כלי הכור אשר יכול לגרום הטיה משמעותית כך מבלי משים פוגעת תוצאות המחקר. עדיף לחסן בשלבים מרובים, קרי לחסן בכל תחנה תרבות אחת אחרי השניה עם הפסקה מדרגות בין כך התאים לא יושבים בצלחת חיסון יותר מ-15 דקות.
בנוגע לשימוש יומיומי, שמירה על עקרות היא חיונית. למרות המערכת נמצאת במצב בטיחות ביולוגית cabinet, עקרות אינה מובטחת עקב התנועה תכופים בין מכסה המנוע. כתוצאה מכך, כל דבר עובר בשכונה חייב ריסוס עם 70% IPA. שנית, זה חיוני כדי להבטיח כי קצף מינימלי מתרחשת במהלך התרבות; מדיה ניתן לסתום ההמתה, פליטה קווים, מוביל לפגיעה של קלאמפ צלחת, אפילו רכיבי הליבה להלן. תוספת אנטי-קצף מונעת שלבים הם קריטיים בתכנון תוכנית כלשהי ביוריאקטור מיקרו. במקרה של קצף”החוצה” זה יהיה מועיל לעקוב היצרנים ניקוי פרוטוקול, יכול למנוע נזק בלתי הפיך של קלאמפ צלחות. לחלופין, השימוש בכלי שאינו sparged עשוי להיות מועיל עבור צפיפות התא התחתון או בעת הפעלה במצב אצווה כמו משטח גבוה יותר ליחס נפח מאפשרת חמצן יעילה גם עם חוסר sparger. עם זאת, כלי שאינו sparged ייתכן שימושי עבור תרביות תאים גבוהה צפיפות או זלוף כמו המרחב הראשי אינה מספיקה לשמור על קשר עם התרבויות גדלה צריכת החמצן.
ישנם יתרונות רבים הניתנים על ידי מערכת microbioreactor, כיוון שהוא מאפשר תרבויות רבות מבוקרת לפעול במקביל בקנה מידה קטן, עם שליטה רבה יותר מאשר לנער מבחנות. 17 לכן, המערכת מקלה על הביצוע של הקרנת מחקרים, האם, תפוקה גבוהה שיבוט מחקרים ולימודים תרביות תאים. טיפול בנוזלים אוטומטית גם מפחית אנליסט-כדי-אנליסט השתנות תוך מזעור בו זמנית עבודה מייגעת וגוזלת זמן עבור צוות מיומן. אמנם ישנם מספר יתרונות למערכת, ישנם מספר חסרונות מפתח הנחשבות. ראשית, נפח תרבות של 15 מ”ל באופן משמעותי מגביל בתהליך הדגימה חומר הקציר הסופי ואת ריאקטורים בקנה מידה קטן אלטרנטיביים מרובים (עד 500 mL) לאחרונה הופכים לזמינים. אחת האחרונות לקידום למערכת הוא השילוב של ביוריאקטור microscale אוטומטית במנתח BioProfile FLEX 2 מנובה ביו, אשר מפחית את הסיכון של הנושא בתוך תהליך דגימה על-ידי צמצום נפח דגימה לניתוח צפיפות, מזין תא . יתרונות באפשרותך לכלול התקנה מהירה, כמעט אין המוביל ניקוי חיסכון תפעולי, אולם העלות של יחידות חד פעמיות צריך להיחשב לפרויקטים לטווח ארוך ככל שיהיה costlier לרכוש היחידות מאשר המערכות המקובלת לשימוש חוזר.
השיטה המתוארים במסמך זה מתאים בעיקר תרבית תאים במצב אצווה, אך יכול להיות שונה בהתאם לצרכים של המשתמש. בכל תחנה תרבות יש שליטה עצמאית של טמפרטורה, בעוד לעשות ו- pH יכולים להיות מגוונים ברמה של כלי הכור בודדים. החייטים מציע גם DoE תכנון תוכנה שתוכננה במיוחד כדי לאפשר ניסויים כדי להתאים את המערכת ביוריאקטור מיקרו. מחקרים DoE בקנה מידה גדול באמצעות התוכנה החדשה DoE המסופקים על ידי היצרן יכול לסייע בתקשורת, תוספת אופטימיזציה. אמנם לא משמש כאן, מערכת microbioreactor מאפשרת גם מחקרים האכיל-אצווה. עדיין לא מוטבה המערכת עבור תרביות תאים זלוף. עם זאת, היו מוגבלים מחקרים וניסויים לחקות זלוף תא תרבות מבצע במערכת ביוריאקטור מיקרו הנוכחי. 26 בשיטה זו ניתן לשנות לחקות תרבויות זלוף צפיפות גבוהה על ידי תא ליישוב. על ידי שינוי הגובה שאליו pipet מוכנס לתוך הכור ועל -ידי אופטימיזציה של זמן הייבוש, התקשורת ניתן יהיה להסיר, מתחדש למצב שמלבלב מראה של תרבות. ישנם מוצרים חדשים בתחום המתפתח יכול לעבוד טוב יותר המערכת המוצגת כאן אם זלוף מצב של תרבות רצוי.
לסיכום, מחקר זה מדגים את השימוש מיקרו אוטומטיות-ריאקטורים ומקושרת אנליטי לפעולות תרבות תא צ’ו לייצר, לאפיין נוגדן IgG1 Monoclonal מודל. זה מדגיש את משחק התפקידים מיקרו-ריאקטורים בקנה מידה קטן bioprocess הייצור, שלהם השפעה על התפתחות התרבות תא ההקרנה מדיה. אמנם ישנם יתרונות רבים לשימוש מערכת ממוכנת בקנה מידה קטן, הבנו את היתרונות שלהם לעבד הבנה, אפיון אנליטי הכרחי. מחקר זה מספק את המשתמש עם קו מנחה לשימוש מערכת הכור microscale אוטומטית, כי ניתן פיתחה השתפר לכל הצרכים מחקר אישיים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות סקוט לאוטה על התמיכה האנליטית שהם סיפקו. מימון פנימי חלקי ותמיכה עבור עבודה זו סופק על ידי CDER התוכנית נתיב קריטי (CA #1-13). פרויקט זה נתמך בחלקה על ידי פעילות התוכנית השתתפות ההתמחות/מחקר מוצרי Office של ביוטכנולוגיה, ארה ב המזון והתרופות, מנוהל על ידי המכון אוק רידג מדע וחינוך דרך כל הסוכנויות הסכם בין משרד האנרגיה האמריקני ה-FDA.
Materials
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C., Hu, W. -. S. . Cell Culture Bioprocess Engineering. , 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R., Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. . The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. , 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -. H., Chu, I. M., Hwang, S. -. M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -. T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -. M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
