JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Published: August 29, 2018
doi:
10.3791/58152
, , , ,
1Hotchkiss Brain Institute, Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology Program, Arthur and Sonia Labatt Brain Tumor Research Centre,The Hospital for Sick Children

Summary

Burada, kantitatif geçiş ve zamanla ve birden fazla tedavi koşullar altında işgal glioblastoma Beyin tümör kök hücrelerin ölçmek için canlı hücre görüntüleme teknikleri açıklar.

Abstract

Glioblastoma (GBM) kötü mevcut tedavi seçenekleri ile kontrol edilir bir saldırgan beyin tümörü olduğunu. Anahtar şekil-in GBMs hızlı yayılması ve normal beyin içine yaygın işgali içerir. Yineleme radyo ve kemoterapi dayanıklı Beyin tümör kök hücrelerin ilk kanserli kitle uzak istila ve böylece, cerrahi rezeksiyon kaçmasına (BTSCs) varlığı neden düşünülmektedir. Bu nedenle, BTSCs ve invaziv yeteneklerini hedef terapiler bu hastalığın Aksi takdirde kötü prognoz artırabilir. Bizim grup ve diğerleri başarıyla kurulan ve GBM hasta numuneleri BTSC kültürler ile karakterizedir. Bu BTSC kültürler klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar kendini yenileme, çoklu soy farklılaşma ve bağışıklık eksikliği farelerde tümör başlatma gibi temel kanser kök hücre özelliklerini göstermektedir. GBM için güncel tedavi yaklaşımları üzerinde geliştirmek için daha iyi BTSC geçiş ve işgal mekanizmalarının anlaşılması gereklidir. GBM, geçiş ve işgali, kısmen, tamamen neurospheres yetiştirilen BTSCs vitro büyüme özellikleri için hesap yapmak mevcut teknikleri sınırlamaları nedeniyle sınırlıdır. Burada, BTSCs göç ve işgal özelliklerini incelemek için hızlı ve nicel canlı hücre görüntüleme deneyleri tarif. Açıklanan ilk yöntem doğru chemoattractant degrade geçiş ölçen BTSC geçiş tahlil olduğunu. Açıklanan ikinci yöntemi BTSC işgali tahlil hangi görüntüleri ve neurospheres hücresel yaratıklardan bir matris içine quantifies. Burada açıklanan deneyleri BTSC geçiş ve istila zaman içinde ve farklı tedavi koşullar altında quantification kullanılır.

Introduction

Glioblastoma (GBM) beyin kanseri en sık görülen ve agresif şeklinde ve, geçerli terapi rağmen cerrahi rezeksiyon içeren radyasyon tarafından takip ve kemoterapi, hastalarin medyan sağkalım sadece 15 ay1. GBM invaziv, çok ilaca dirençli ve sonuçta, gerektiren bir hastalığı yeni tedavi yolları tanımlamak için onun doğasında Biyoloji araştırma devam. GBM hastaların yüksek ölüm oranı öncelikle geniş hücresel işgal içine bitişik normal beyin dokusu ve tedavi2,3 takip hastalığın nüks için uzanan geçiş boyunca kan damarları, neden olur . Bisiklete binme ve tedavi amaçlı dayanıklı, Beyin tümör kök hücreler (BTSCs), yavaş olarak adlandırdığı hücre alt grubunu hastalık nüks götürecek olan. GBM BTSCs klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar kendini yenileme, multipotency ve tümör başlatılıyor potansiyel4,5,6özelliklerini görüntüler. BTSCs da onların üst GBM tümörler7,8,9,10genetik, moleküler ve fenotipik heterojen korurlar. Bu özellikleri BTSCs bir son derece faydalı model sistem GBM çalışma için ve yeni tedavi stratejileri keşfetmek için yapar. Vivo, bu kök benzeri hücreler tümör oluşumu, büyüme ve neonatal fareler11 beyinlerinin implante zaman işgal yeteneğine sahiptirler ve obez olmayan şeker hastası/ağır kombine immün yetmezlik (NOD/SCID) fareler4. BTSCs tekrar tekrar formu invaziv tümörlerin vivo içinde onların orijinal tümör hücresel ve histolojik özellikleri güçlü özetlemek yeteneği tümör başlatılıyor hücreler12olarak destekler.

Yeni tedavi yaklaşımları hedef BTSCs geliştirilmekte olan ve uzun vadeli sonuç GBM hastalar için geliştirmek. Şu anda, tedavi direnci ve yineleme ile ilişkili olan hücresel göç ve işgal süreçleri anlamak sınırlı olduğunu. Geçiş ve işgal farklı olayları. geçiş hücreleri yönlendirilmiş hareketin temel işlem ve istilası da engelleri fiziksel imha gerektirir, ancak yeniden yapılanma sitoiskeleti, adezyon molekülleri ve montaj/demontaj odak iletişim noktalarının içerir bir hücre dışı matriks13gibi. Hücre göç ve işgal eğitimi yaygın olarak kabul edilen bir metodoloji Boyden odası tahlil14,15‘ tir. Bu teknik, Çift kişilik bir oda medya bir chemoattractant ile desteklenmiş alt kamara medyada ile doludur. Kemotaksis belirli büyüme faktörleri veya sitokinler veya fetal Sığır serum spesifik olmayan chemoattractant kullanarak tetiklenir. Chemoattractant geçişin hücreleri geçirgen membran geçirilir. Uç noktada geçirilen hücreleri görüntülenir ve membran dibinde saytolojik veya floresan boyalar ile boyama tarafından sayılabilir. Geçiş tahlil bir istila tahlil gözenekli kaplama tarafından değiştirilebilir Boyden filtre türü gibi hücre dışı matriks bileşenleri ile ben kollajen veya membran benzeri matris. İnvaziv hücreleri matrisin aşağılamak, gözenekli filtre alt hareket ve geçiş tahlil için benzer bir şekilde sayılabilir. Hücre dışlama bölgesi13deneyleri ve diğer sık kullanılan geçiş deneyleri yara çizilmeye içerir. Kazı-kazan yara tahlil bir hücresel monolayer bir boşluk tırmalamak ve çizik kapatılana kadar hücreler yara kenarına geçirilmesi yanında düşsel düzenli aralıklarla gözlemleyerek gerçekleştirilir. Hücre dışlama assay olarak, fiziksel bir bariyer hücrelerinin tohum önce bir boş hücre bölgesi oluşturmak için kullanılır. Bir kez kaldırıldı hücreleri konfluent ve hücrelerin göç boş hücre bölgesi haline bariyer düzenli olarak16görüntüsü.

Bunlar daha önce kurulmuş deneyleri sık geçiş veya yapıĢık ve homojen hücre popülasyonlarının ama poz önemli dezavantajları işgali GBM BTSCs veya diğer türdeş olmayan kanser hücre popülasyonlarının okurken çalışmak için kullanılır. Boyden odası tahlil yalnızca bitiş noktası ölçümleri karşı kinetik değerlendirilmesi hücre hareketi oluşturabilirsiniz. Hücreleri farklı kültürlerden kez farklı oranlarda göç verilen zaman içinde bir gözlem BTSC geçiş, ölçümü için yüksek alaka ‘s. Bu nedenle, koşullar ve zamanlama testin her kültür türü için optimize edilmiş olması gerekir ve yeterli örnekleme ve miktar için zaman yoğun emek gerektirir. Ne zaman bile BTSCs laminin kaplı plakalar üzerinde monolayer koşullarda kültürlü, biz BTSCs hareket açık uzaya karşı ve kalmak tercih için görünür gözlemledim gibi deneyleri BTSC kültürler için uygun değildir çizik ve hücre dışlama kapatın diğer hücrelere yakınlık. Ayrıca, bunlar geçiş deneyleri görselleştirme ve tek tek hücreler bir deney boyunca izlenmesi için izin vermez kurdu. BTSCs. ek dezavantajları Boyden odası, çizik ve hücre-dışlama bölgesi deneyleri BTSC kültürler için bu gibi tek tek hücreler zamanla izleme türdeş olmayan hücre popülasyonlarının geçişinde değerlendirilmesi için değerlidir onlar nispeten gerektiren yüksek cep numaraları,-ebilmek var olmak kurmak zaman alıcı ve ya hızla equilibrate veya chemoattractant gradyan yok. Bu nedenle, bu deneyleri için nadir veya yavaş büyüyen hücre popülasyonlarının veya uyuşturucu taraması kullanmak ideal değildir. Ayrıca, bu deneyleri neurosphere koşullar altında yetiştirilen BTSCs için özellikle önemli bir üç boyutlu (3D) biçiminde bir işgal ölçmek için uygun değil.

Burada, özellikle gözlem ve miktar için bireysel BTSCs ve GBM neurospheres kültürlü BTSCs işgali için göç için modifiye deneyleri tarif. İlk tahlil kemotaktik hücre geçiş13ölçmek için canlı hücre zaman hata görüntüleme ve kemotaksisi geçiş plaka kullanarak Boyden odası tahlil bir uyarlaması açıklar. Görselleştirme ve miktar birden fazla tedavi koşullar altında hücre göç için çok iyi bir biçimde canlı hücre görüntüleme sağlar. Burada açıklanan ikinci tahlil bir küresel işgal tahlil13,17, hangi önlemleri BTSCs invaziv özelliklerini neurosphere koşullar altında kültürlü ve çeşitli tedavi altında bir 3D hücre dışı matriks içine gömülü olduğunu koşullar. Genel olarak, bu deneyleri çok daha heterojen BTSC kültürlerin göçmen ve invaziv özellikleri eğitim için önceden açıklanan yöntemleri daha uyumludur. Ayrıca hem göç ve işgali, hastalık nüks ve lethality için önemli ölçüde katkıda hedeflemek için yeni tedavi stratejileri incelenmesi için daha iyi fırsatlar sunuyoruz.

Protocol

1. Beyin tümör kök hücre kültürü çalışmalarının daha önce insan Glioblastoma örnekler elde edilen Not: BTSC kültürler insan GBM hasta numuneleri6,7,8,9,10′ dan daha önce kuruldu. % 70 etanol, 37 ° C’de bir su banyosu içinde sadece son buz çözdürülen kadar yerleştirilen içeren bir ölçek cryogenically korunmuş BTSCs bir şişe çözülme. Medya bir 15 mL konik tüp 10 mL çözdürülen hücrelerde sulandırmak ve hücreleri 150 göreli merkezkaç kuvvetleri (RCF) için 7 dk, santrifüj kapasitesi.Not: Bu protokollerin tam medya standart medya Kültür (daha önce açıklanan tarafından Kelly vd.) BTSCs için kullanılan ifade eder 6, genellikle ile büyüme faktörleri mevcut. Medya büyüme faktörleri olmadan temel medya tüm bileşenleri içeren ancak desteklenen herhangi bir büyüme faktörleri ifade eder. Medya Aspire edin, tam medya 8 mL hücrelerde resuspend ve hücreleri ve medya T25 şişesi aktarın. 1 hafta yapışık olmayan koşullar altında kültür sonra şişeye her gün izlemek ve 1-2 mL tam ortam içeriğiyle ek gerektiği gibi medya tüketmek başlar veya asidik bir turuncu-sarı renk değişikliği tarafından belirtildiği gibi olmaya başlar. Neurospheres tipik arasında 10-14 d (Şekil 1) yaklaşık 250 mikron çapında ulaştığınızda geçiş hücreleri.Not: Yaygın olarak farklı BTSC kültürlerin katlama süresi değişir. Neurosphere boyutu bir oküler mikrometre kullanılarak ölçülebilir. BTSCs geçiş için medya toplamak ve medya pipetting tarafından neurospheres tüm neurospheres toplamak ve 15 mL konik tüp aktarmak için balonun yüzeyinde ve tüp 150 RCF, 7 dk santrifüj kapasitesi.Not: Tüm neurospheres toplanan emin olmak için mikroskop altında şişeler kontrol edilebilir. Ek bir yıkama ile fosfat 5 mL serum fizyolojik (PBS) arabelleğe alınmış veya medya kalan herhangi bir neurospheres gerekli toplamak için gerçekleştirilebilir. Tek Kişilik hücrelere BTSC neurospheres ayırmak için medya Aspire edin ve önceden ısıtılmış hücre dekolmanı çözümü 1 mL ekleyin ve 7 dk. 37 ° C’de BTSC süspansiyon 40 x ile bir P1, 000 micropipette 800 μL ayarla Triturate kuluçkaya.Not: Eğer neurospheres değil ayırmak hücreleri artık 37 ° C’de inkübe. PBS (antibiyotikler penisilin ve streptomisin ile) 5 mL Disosiye BTSCs ekleyin ve 7 min için 150 RCF hücreleri santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve tam medya, hücre Pelet büyüklüğüne bağlı olarak 1-4 ml BTSCs resuspend.Not: Hücre süspansiyon konsantrasyon doğru hücre sayımı için doğru algılama sınırını aşan ise daha seyreltilmiş gerekiyor. Ölü hücreleri hariç bir boya kullanarak, mavi trypan gibi hücrelerin sayısını ve BTSCs şişesi veya plaka ilgi tohum — genellikle, 200.000-300,000 hücreleri tam bir T25 şişesi medyada 8 ml. 2. Beyin tümör kök hücre göç tahlil Tohum 200.000 hücrelerde tam ortam geçiş tahlil yapmayı planlamadan önce 1-2 hafta 8 mL bir T25 şişesi.Not: kaplama ve tahlil gerçekleştirme arasında geçen zamanı kullanılan BTSC kültür büyüme hızının bağlı olarak değişir. Geçiş bir uyuşturucu tedavi etkisini test etmek için hücreleri içeren medya ayrı kuyu doğrudan araç ya da uyuşturucu stokunun ilgili birimleri ekleyerek DMSO ve uyuşturucu ilgi gibi uygun aracın bulunduğu hücreleri pretreat. Kemotaksis geçiş plaka (Şekil 2A) kolajen ince bir tabaka ile kaplama tarafından hazırlayın. Kollajen ile kaplı olması gerekir bir 96-şey kemotaksisi plaka kuyu sayısını hesaplayın. Her koşul için en az üç Çoğalt kuyu bulunmaktadır. Seyreltik 5 mg/mL stokunun tip ı kollajen 0.2 mg/ml saf asetik asit %0.14 kültür sınıf suda seyreltilmiş. 0.2 mg/mL kollajen membran Ekle wells ve kullanılmakta olan alt rezervuar kuyuları için pipet.Not: Alt rezervuarlar plaka 225 µL çalıştırmaları ve membran Ekle wells 75 µL kollajen için uygun bir kaplama gerekir. Yer 1 h. için bir kuluçka-37 ° C’de geçiş plaka kollajen kaplama tırmalamak olmadan kollajen çözüm kuyulardan Aspire edin. Kuyu 2 yıkama x steril 1 x PBS ile. Kalenin hemen değil kullanılıyorsa, PBS Aspire edin ve 4 ° C’de 2 hafta için saklayın. Kullanılmadan önce oda sıcaklığında kemotaksisi geçiş plakasına sıcak. Kemotaksis geçiş plaka alt rezervuarı hazırlayın. 225 µL % 10 ile desteklenen medya (olmadan büyüme faktörü), pipet FBS alt rezervuar kuyu kemotaksisi geçiş plaka yapımı için bir chemoattractant olarak. Yavaşça membran Ekle kabarcıklar oluşturmaktan kaçınmak için açılı alt rezervuar içine yerleştirin. Membran hücrelere eklemek kemotaksisi geçiş plaka plaka. Resuspend BTSCs 50. 000 hücre/mL bir hücre yoğunluğu (büyüme faktörü) olmadan medyada ayrışmış. Uyuşturucu medyaya geçiş farklı ilaç tedavileri sırasında değerlendirme olabilirsiniz. Alternatif olarak, eşit sayıda önceden tedavi hücreleri ve kontrol hücreleri, kaplama ne zaman son ilaç konsantrasyonu koruyarak tohum. BTSCs adım 2.4.1 her kuyuya geçiş plaka istenilen tedavi koşullar altında 50 µL plaka. Görüntü kemotaksisi geçiş. Kemotaksis geçiş plaka canlı hücre görüntüleme sistemi yerleştirin ve plaka mikroskobik görüntüleri otomatik düşsel bilgisayar yazılımı her 1-2 h ilâ 72 h. kullanma ticari yazılım için ayarla (bakınız Tablo malzemeler), sağ tıklayın zaman çizelgesi ve küme her 2 h tarama aralığı 24 h için.Not: Zaman aralığı ve toplam süre kullanılan BTSC kültürler arasında farklı olur; deneyim ile bireysel BTSC kültürleri yayılana kadar 72 h 2 h aralıkları ile başlayın. Otomatik görüntüleme sistemi yoksa, o zaman aynı görüş alanı görüntüleri el ile mikroskop ile elde edilebilir ve bir kamera görüntüleme yazılımı bağlı. Resim alma tamamlandıktan sonra tüm deneme için görüntü elde ve hücre membran ve geçiş gözenekleri (Şekil 2B, kırmızı maske) kökenli farklılaştıran analiz yazılımı kullanarak bir işlem tanımı oluşturma . Ticari yazılım kullanarak (bkz. Tablo malzeme), bir Yeni işlem tanımı ‘ nı seçin ve işlem tanımı için BTSCs için 52, bir eşik büyümek 85, ayarlamalar boyutta bir tohum eşik ayarları (piksel) -1 ve 200 μm kalınlığında2 minimum alan tarafından. Bu işlem tanımı membran alt tarafında geçerlidir. Bunu doğru bir şekilde hücrelerin arka plan membran ayrım yapmaz bu analiz değiştirin. Hücre olarak veri toplama yüzey alanı membran alt yüzündeki her sadece gözenekler geçiş hücreleri sayar üç Çoğalt Wells için. Μm kalınlığında2 hücrelerinde göç grafik (alan hücre geçirilmiş) zaman (2 C şekil, Şekil 3).Not: kaplama ve membran üst yüzeyinde ilk kez noktada sayılan hücre göreli sayısı benzer olduğundan emin olun (daha az % 20 varyasyon genelinde tüm wells) düzensiz kaplama herhangi bir etkileri önlemek için tüm tedavi koşulları arasında. Ticari yazılım ( Tablo malzemelerigörmek) adım 2.5.2, sonra grafik/vermeve daha sonra verileri verme ölçümleri,’ı tıklatarak oluşturduğunuz işlem tanımı başlatarak yürütülebilecek koleksiyon verileri kullanarak . 3. Beyin tümör kök hücre Neurosphere işgali tahlil Tohum 200.000 hücrelerde bir T25 şişesi bir istila tahlil yapmayı planlamadan önce 1-2 hafta içinde tam medya 8 mL.Not: zamanlama üzerinden kaplama tahlil yapmak için kullanılan BTSC kültür yayılması oranına bağlıdır. Neurospheres işgal için kaplama hazır önce ön işleme hücreler için önceden belirlenmiş zamanlı kurs için istenen yoğunlaşması, şişeye faiz bileşik ekleyin. Ortalama neurosphere boyutu yaklaşık 150-200 mikron tamamlanana kadar bekleyin; Genellikle, bu bağlı olarak kullanılan BTSC kültür 7-14 d alır.Not: Balon küre boyutlarda bir dağıtım gözlemlemek için normaldir. İpucu ve yavaşça şişeye bir pipet ile karıştırın ve BTSC neurospheres 500 μL 1,5 mL konik tüp her tedavi koşul için taşımak; Bu üç Çoğalt wells plaka için kullanılacaktır.Not: 3.3.1 – 3.3.2 isteğe bağlıdır, ancak yeni bir BTSC kültür ilk işgali denemeyi için önerilen adımlardır. Kuyuda sona erecek neurospheres yoğunluğunu belirlemek için adım 3.3 olduğu gibi bir 1,5 mL Tüp hazırlayın. Yavaşça neurospheres mix ve 100 μL ayrı 96-şey kalıp taşımak ve 5 min için yerçekimi tarafından yerleşmeye neurospheres sağlar. Neurospheres birden fazla neurospheres emin olmak için mikroskop altında sayısı bölgesinde aşırı kalabalık olmadan görüntüsü iyi kontrol edin.Not: Neurospheres komşu ile etkileşim olmadan çapı üç katına kadar yer işgal neurospheres gerektirir. Neurospheres şey başına sayısı neurospheres iyi başına sayılması ve daha fazla veya daha az neurospheres T25 balonun 1.5 mL konik tüp içinde adım 3.3 ekleme tarafından ayarlanabilir. Adım 3.3 hücrelerden ile 1,5 mL konik tüp buza koyun ve adımları izleyerek 3,5-3.7 buza. Yerçekimi 1.5 mL konik tüp altına tarafından 5 min için yerleşmek ve etiketli bir 96-şey plaka buz üzerinde prechill neurospheres izin verin. Neurospheres hücre dışı matriks protein resuspend. 500 hazırlamak μL 0.4 mg/mL, tip ı kollajen çözüm buz her tedavi koşul: 459 μL medya (büyüme faktörü) olmadan, 5 mg/mL kollajen hisse senedi çözüm 40 μL ve steril 1N 0,92 μL ekleyin NaOH (Tablo 1).Not: kollajen çözeltinin 500 μL tedavi durumu gereklidir: her üç Çoğalt wells ve aşırı 200 μL 100 μL. İlaç tedavileri burada çözüm medya bileşenden gelen düşülen istenen son konsantrasyonu, eklenmesi gerekir. Bu iletişim kuralı kullanımını açıklar tip ı hücre dışı matriks proteini; kollajen Ancak, herhangi bir hücre dışı matriks proteini test edilebilir. Buna ek olarak, BTSC için işgal oranını artırmak için medya işgali, büyüme faktörleri veya FBS yavaş oranlarına sahip kültürler desteklenebilir. Adım 3.5 neurospheres yerleşmiş sonra medya mümkün olduğunca çok olarak alt kısmında yerleşmiş bulunmaktadır neurosphere Pelet kaybetmeden Aspire edin. Yavaşça neurospheres 500 μL 3.6.1. adımda hazırlanan kollajen çözüm içinde resuspend. 96-şey plaka buz üzerinde üç Çoğalt kuyu 100 μL kolajen ve neurosphere karışımı ekleyin. Neurospheres buz üzerinde 5 min için yerleşmek izin verir. 96-şey plaka kollajen polimerizasyon için izin vermek 5 min için 37 ° C kuluçka aktarın. 96-şey plaka görüntüye hemen hazırlayın. 96-şey plaka bir canlı hücre görüntüleme sisteminin veya istila başlamadan önce kaplama sırasında neurosphere boyut için bir başvuru olarak bir görüntü elde etmek için mikroskop sahnede tepsisine yerleştirin. Görüntü oranı işgalinin monoton kadar her saat elde; Genellikle, bu 24 saat içinde ortaya çıkar.Not: Görüntüleme aralığı kullanılan ekipman bağlı olarak değiştirilebilir. Görüntüleme aralığı ve toplam geçen süre de işgalinin farklı oranlarına sahip BTSC kültürler için değiştirilebilir. Zaman içinde matrix işgal gibi BTSCs artan yüzey alanı belirler.Not: Kaplama, üç Çoğalt wells, ortalama hesaplanan zaman hücre yüzey alanı benzer olması gerekir (daha az % 20 varyasyon genelinde tüm wells) BTSC işgali farklılıkları emin olmak için farklı tedavi koşulları arasındaki güçlü sayısı veya boyutu ile kaplama neurospheres tarafından etkilenen. Canlı hücre analiz sistemi 10 X amaç resim alma için kullanın ve üç kuyular çoğaltmak için iyi başına dört görüntü elde etmek. Şey, yüzde izdiham temsil göreli hücre yüzey alanı belirlemek için özellikle iyi arka plan üzerinde hücreleri vurgular bir işlem tanımı ayarlayın. Ticari yazılım kullanarak (bkz. Tablo malzemeler), yeni işlem tanımı’nı seçin ve segmentasyon ayarlama 0.8, 300 mikron2ve merkezcillik minimum alan 0,99 maksimuma ayarlayın. Bunu doğru bir şekilde hücrelerin arka plandan ayrım yapmaz bu analiz değiştirin.Not: Eğer görüntü neurosphere işgal zaman içinde diğer yöntemleri kullanarak, bu üç kuyular zamanla çoğaltmak için birden çok alan bakış elde etmek için tavsiye edilir. Ancak, tam olarak aynı görüş alanı her aralıkta Imaging değil toplanan veriler standart hatasını artacaktır. Bilgisayar yazılımı her görüntü işgal hücrelerinin yüzey alanı ölçmek amacıyla kullanılabilir. Veri toplam hücre yüzey alanı (göreli veya mutlak) her şey için her zaman-nokta toplamak ve üç Çoğalt wells ortalamasını belirlemek. Avusturya’nın BTSCs zaman içinde artan hücre alan komplo tarafından grafiğini çizin.Not: ticari yazılım kullanarak veri toplama (bakınız Tablo reçetesi) yürütülen adım 3.10.1, ölçümlerive sonra grafik/verme,’ı tıklatarak oluşturulan işlem tanımı başlatarak ve üzerinde veri verme .

Representative Results

Burada, canlı hücre görüntüleme deneyleri BTSC geçiş ve işgal çalışmaya kullanılarak elde edilebilir veri örnekleri açıklar. BTSCs tek hücreler olarak kaplama ve serbest yüzer neurospheres (Şekil 1) yetiştirilir. Biz BTSCs ayrışmış ve membran ekleme türü ince bir tabaka ile kaplanır bir kemotaksisi geçiş plaka Wells kollajen (Şekil 2A) kaplama gösteriyor. Bireysel BTSCs eşit tahlil başında membran Ekle üst dağınık. Bir süre 24-72 saat içinde hücre membran için uygun, kolajen kaplı yüzey hareket ve alt tarafına doğru bir chemoattractant Reservoir membran 96 küçük gözenekleri biri üzerinden de göç. Sarı, gözenekleri mavi ve kırmızı membran altındaki hücre membran üstüne hücreleri vurgulama sonra hücre içinde gözenek üstte (sarı hücre mavi gözenek yaklaşıyor) girerek görülebilir ve gözenek altta (kırmızı hücre çıkış çıkarken ING mavi gözenek) (Şekil 3). Önemlisi, hücreler uyuşturucu tedavi ve aynı kemotaksisi geçiş plaka araç tedavi kontrol hücreleri tedavi müdahaleler etkisi BTSC geçiş (Şekil 2B) çalışmaya olarak kaplama olabilir. Kemotaksis geçiş plaka üstünde belgili tanımlık tepe ve membran Ekle altındaki hücreleri görüntüleme sağlar. Bu nedenle, zaman içinde hücre göçü miktar membran (Şekil 2C) alt tarafına geçiş hücreleri sayarak mümkündür. BTSCs tam ayrışmış değil, hücreleri değil gözenekler göç ve küçük neurospheres (Şekil 4A) kalır olduğunu bulduk. Ayrıca BTSCs/iyi topaklanma Hücre yerine alt tarafa geçirilmesi membran (Şekil 4B) bu sonucu olarak değil daha fazla 2.500 plaka için önemlidir. Son olarak, bu doğru görüntüleme ve miktar (Şekil 4 c) engeller gibi hücreleri ve eklediğinizde alt rezervuar yerleştirerek Membran Kaplama wells eklemek kabarcıklar zarda önüne geçmek için esastır. Ardından, BTSC yaratıklardan neurospheres çevreleyen matris içine görüntüsü ve zaman içinde bir 96-şey plaka biçimi (5A rakam) sayısal gösterir. İstila istila ettiler matrix zamanla gibi hücre yüzey alanı miktarının ölçülebilir. Bir maske hücrenin üzerine bindirmeleri yüzey o zaman (Şekil 5B) içinde otomatik miktar sağlar alan görüntü analiz yazılımı kullanarak, bir işlem tanımı uygulandı. BTSC akınları hızlandırılmış videoları de, kolayca BTSC işgali (Şekil 6) işlemindeki gözlemlemek için oluşturulabilir. Buna ek olarak, floresan mikroskopi görüntü floresan proteinler, yeşil flüoresan protein (GFP) veya kırmızı floresan protein (RFP) gibi hızlı BTSCs için kullanılabilir. Burada, bir membran benzeri matris (Şekil 7) işgal gibi bireysel BTSCs takip etmek için GFP sitozolik şeklinde ifade BTSCs bir hızlandırılmış video oluşturduk. Bu BTSC neurosphere işgali tahlil da Çoğalt wells eklenecek ilaç tedavileri doğrudan bir matris (8A rakam) içine neurospheres BTSC yaratıklardan üzerindeki etkileri değerlendirmek için izin verir. Çoğalt Wells birden çok neurospheres miktar hesaplanır ve ilaçlar (8B rakam) birden fazla konsantrasyonlarda etkisini değerlendirmek için zamanla Grafiği çizilecek. Yukarıda açıklanan protokolüne uymayı başarısızlık bir yetersizlik için güvenilir ve doğru verileri elde etmek için yol açabilir. Çok büyük BTSC neurospheres gömme, 200 µm büyük çaplı uçağa doğru alan bakış (Şekil 8 c) tüm küreler ölçmek için çok büyük odak yol açar. Benzer şekilde, matris 4 ° C’de neurospheres gömme süre korumak için başarısızlık da odak ve doğru veriler (Şekil 8D topluluğu önleyen, düzgün, katılaşmış değil bir hücre dışı matriks aynı uçakta olmayan alanlara yol açabilir ). Şekil 1: BTSCs kültür. Bu paneller tek hücre kültüründe 14-d sürecinde neurospheres için yetiştirilen BTSCs temsilcisi bir örnektir. Burada gösterilen gün 14 neurospheres passaging için uygun bir boyut vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: Live-hücre görüntüleme BTSC göçün. (A)bu türü ince bir tabaka ile ben BTSCs ile geçiş tahlil gerçekleştirmeden önce kollajen kaplı bir 96-şey kemotaksisi geçiş tabak örneği. İ) bir tabak üç ile resimleri göstermesini parçalar (kapak, membran Ekle ve rezervuar) yerleştirilen birlikte, ayrılmış, II) her üç parçaya membran INSERT, membran Ekle alt görünümünü IV) bir yakın çekim resmin üst görünümünü III) bir yakın çekim resmin ve v) alt baraj gölünün bir yakın çekim resmin. (B) Bunlar bir BTSC geçiş deneme başlangıcı (0 h) ve 24 h temsilcisi görüntülerdir. Görüntü odağı nerede hücreleri aslında kaplama membran Ekle üstünde olur. Kemotaksis geçiş plaka altına geçirilen kırmızıyla vurgulanır. 0 h birkaç hücre zarının alt tarafına göç var. 24 saat sonra geçirilen hücre sayısı önemli ölçüde artmıştır. Bir araç vs uyuşturucu ile X tedavi hücreler için 24 h görüntülerin karşılaştırma ilaç tedavisi BTSC geçiş azalır gösterir. Ölçek çubukları temsil 600 µm. (C) Bu panel takip BTSC geçiş miktar bir araç veya uyuşturucu X ile ön arıtma gösterir. Grafik, ilaç tedavisi BTSCs geçirilmesi üzerinde güçlü bir etkisi gösterir. Veri noktalarıdır üç teknik Çoğalt wells ortalaması ve standart sapma (SD) hata çubukları temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Animasyonlu resim 3: BTSC geçiş hızlandırılmış video. Bu videoyu BTSCs geçiş gösterir-kolajen kaplı bir türü kullanarak kemotaksisi geçiş plaka. Membran Ekle üst kısmında sarı renkte vurgulanır, membran Ekle altına geçirilen kırmızıyla vurgulanır ve gözenekleri zarda mavi renkle vurgulanır. Odak düzlemi görüntü hücre zarının alt tarafındaki ayarlanır. Video her saat 51 h için alınan ve saniyede 4 kare hızında derlenmiş hızlandırılmış görüntüleri kullanılarak oluşturulmuş. Ölçek çubuğu 200 µm. lütfen buraya tıklayın Bu videoyu izlemek için temsil eder. (İndirmek için sağ tıklatın.) Şekil 4: geçiş tahlil kurulum hataları örnekleri. Bir tam olarak en iyi membran Ekle kemotaksisi geçiş plaka üzerine kaplama önce ayrışmış değil BTSCs örneği (A) Bu panel gösterir. Büyük boyutlu küre ve membran gözenekleri küçük boyutu nedeniyle, hücreleri alt havzanın göç edemiyoruz. (B) Bu panel nerede çok fazla hücreleri kaplama bir geçiş assay bir örneği gösterilir. Hücreleri topaklanma Hücre göç ile müdahale ve miktar bozar. (C) Bu panel nerede BTSCs kaplama membran Ekle kabarcık oluşumu bir örneği gösterilir. Kabarcıklar kötü görüntü kalitesine neden ve geçiş doğru bir miktar önlemek. Ölçek çubukları 600 µm. temsil Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5: BTSC neurosphere işgali tahlil. Bu paneller bir örnek BTSCs istila bir neurosphere 0.4 mg/mL türü ben kollajen matris 6 h dönemde göstermek. Burada,(a)faz kontrast görüntüler her zaman noktasında (B) overlaid, temsilcisi nicel maskeyle Protokolü adım 3’te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6: BTSC neurosphere işgali hızlandırılmış video olarak tip ı kollajen. İşgali BTSCs gelen bir neurosphere 0.4 mg/mL içine bir video bu gösterir tip ı kollajen matris (Ayrıca hala resim Şekil 5Aolarak gösterilir). Görüntüleri 10 X amaç her saat için 12 h kullanarak satın alınan ve saniyede 4 kare hızında derlenmiş. Ölçek çubuğu 300 µm. lütfen buraya tıklayın Bu videoyu izlemek için temsil eder. (İndirmek için sağ tıklatın.) Şekil 7: BTSC neurosphere işgali hızlandırılmış video bir membran benzeri matris. Bu video BTSCs, bir neurosphere bir membran benzeri matris içine gelen bu ifade sitozolik GFP işgali gösterir. Görüntüleri bir 4 X amaç her 30 dk. 48 h için kullanarak satın alınan ve saniyede 8 kare derlendi. Ölçek çubuğu 800 µm. lütfen buraya tıklayın Bu videoyu izlemek için temsil eder. (İndirmek için sağ tıklatın.) Şekil 8: BTSC neurosphere işgali tahlil tedavi ile. (A) BTSC neurospheres araç veya uyuşturucu X. görüntüleri her saat; elde belirtilen konsantrasyonları ile hazırlanan bir membran benzeri matris gömülü Burada gösterilen resim kaplama zamanda 16 h sonra alınır. Ölçek çubuğu 200 µm BTSCs çevreleyen matris içine bir işgal neurospheres gelen her saat Protokolü adım 3’te açıklandığı gibi sayısal. (B) temsil eder. Üç teknik Çoğalt wells ortalaması veri noktalarıdır ve hata çubukları (SEM) ortalama standart hatasını temsil eder. (C) Bu panel BTSC neurospheres gömülü tip ı kollajen miktar için çok büyük bir küre ile gösterir. Ölçek çubuğu 300 µm BTSC neurospheres gömülü yazın ben tam ayarlı değil kollajen Bu panel gösterir. (D) temsil eder. Ölçek çubuğu 300 µm. temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Kollajen eriyik hazırlığı Hisse senedi [kollajen] (mg/ml) 5 Final [kollajen] (mg/ml) 0,4 Gerekli kuyu sayısı: 5 Toplam hacim (μl) 500 Birim hisse senedi kollajen (μl) 40 1N NaOH (μl) hacmi 0.92 Medya (μl) hacmi 459 Tablo 1: 0.4 mg/mL hazırlanması tip ı kollajen çözüm. Listelenen bilinen başlangıç ve istenen son konsantrasyonları türü olduğundan ben kollajen çözüm. Listelenen birimlerden plaka neurospheres içine üç Çoğalt wells, artı iki aşırı için yeterlidir ve bir tek tedavi durum protokolü adım 3’te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi içerebilir.

Discussion

Kanser hücreleri aktif Proliferasyona olduğunu göz önüne alındığında, bu hücre göç incelenmesi için potansiyel bir teknik sorun teşkil etmektedir. Burada açıklanan geçiş tahlil için hangi belgili tanımlık hızla çoğalmak sınırlar büyüme faktörleri, BTSCs kaplama ve chemoattractant degrade kemotaksisi plaka tam 72 saat boyunca equilibrate değil. Zaman içinde yaşamak-hücre Imaging’i kullanma hücreleri izlenmektedir gibi Ayrıca, hücreleri görsel olarak yaygın hücre bölünmesi meydana olmadığı emin olmak için takip edilebilir. Geçiş tahlil başarı için neurospheres tek kişilik hücrelere tamamen ayırmak ve doğru bir şekilde kaplama önce hücre sayıları saymak önemlidir. Küreler kaplama veya topaklanma, sonuçları küçük gözenekleri (Şekil 4A ve 4B) geçiş hücreleri önlemek çok fazla hücreleri kaplama. Kabarcıklar kemotaksisi geçiş plaka hücrelerde kaplama ya da membran Ekle alt rezervuar yerleştirirken karışıklık yaratarak önlemek önemlidir. Kabarcıklar alter odak düzlemi ve doğru miktar (Şekil 4 c) engelleyebilir. Tüm plaka bu tahlil hücrelerin uygun ve chemoattractant biyolojik ilgili bir yüzeye arasında geçirmek için gerekli gibi bu plaka, gözenekleri açmak gezinmek için bir yüzey hücreleri verir çünkü kollajen ince bir tabaka ile kaplı olması gerekiyor.

Tek hücre göç, varolan iletişim kurallarına göre farklı tedavi koşulları test etmek için daha az sayıda hücre gerektiren kinetik değerlendirilmesi için burada açıklanan BTSC geçiş protokolü sağlar. Bu hücreler deneme için çok sayıda toplamak zor olabilir gibi bu çok yavaş bir şekilde büyümek kültürler için önemlidir. Kemotaksis geçiş plaka düşük gözenek yoğunluğu chemoattractant geçişin 72 h büyük daha yavaş bir denge için izin verir ve daha etkili bir şekilde kemotaktik geçiş daha uzun vadede biyolojik süreci taklit eder. Protokol tahlil önlemler göç ve işgal değil emin olmak için kemotaksisi geçiş plaka üzerinde kollajen kaplama çok ince bir tabaka için optimize edildi. Onlar membran Ekle kaplama kollajen matris uygun gibi aynı zamanda görüntüleme ve tek hücre miktar kolaylaştırır. Ancak, teknik bir sınırlama birden çok kuyular arasında geçiş zamanla miktar büyük ölçüde basitleştirilmiş ve hızlandırılmış ticari yazılım kullanarak olmasıdır ( Tablo malzemelerigörmek). Bir önemli geçiş tahlil burada açıklandığı gibi geniş uyum protokolünün diğer hücre tipleri için avantajdır. Her iki yavaş, uygun veya yavaş yavaş geçiş zor büyüyen hücre satırlarını kemotaktik göç miktarının için özellikle faydalı olacaktır.

BTSC işgali testin başarılı olmasını sağlamak için onlar 200 µm. daha büyük alanlarda sürekli olarak görüntü ve (Şekil 5C) ölçmek için çok büyük odak bir uçak var daha büyük haline gelmeden neurospheres toplamak gereklidir. Ayrıca, neurospheres yığın ve diğer neurospheres ile toplam başlayabilirsiniz. Bu doğru ve tutarlı veriler edinimi etkiler. Buna ek olarak, neurospheres hala buz odak (Şekil 5 d) tek bir düzlemde yansıma neurospheres izin vermek için kollajen açıkken kuyunun yerleşmek için izin verilen esastır. Benzer şekilde, tam olarak bu görüntü kalitesi (Şekil 5 d) olumsuz yönde etkileyebilecek hatta bir matris oluşumu bozabilir plaka hareket ettirmeden ayarlamak kollajen izin vermek önemlidir. Burada açıklanan BTSC işgali tahlil için en büyük avantajlarından biri BTSCs neurospheres kültürlü işgal için doğrudan adherently yetişkin olmak gerek kalmadan tespit edilebilir olduğunu olduğunu. Ayrıca, BTSC neurospheres hücre dışı matriks belirli bir dokusundan bireysel bileşenleri kullanarak veya piyasada bulunan membran karışımı kullanarak herhangi bir hücre dışı matriks içinde gömülü olabilir. Hücre dışı matriks belirtme tanımlamak veya belirli mekanizmaları işgalinin sınamak için yardımcı olabilir. Örneğin, bu protokolü ile tek tek üyelere özel matris bileşenleri aşağılamak için bilinen genlerin matris metallopeptidaz ailesinin hedefleme etkisini değerlendirmek mümkündür. Alternatif olarak, bu iletişim kuralı için BTSC neurospheres özgü olsa da, herhangi bir hücre küreler yetiştirilen benzer bir biçimde kullanılabilir. Meme kanseri hücrelerinin mammospheres veya birincil kolorektal kanser hücrelerinin tumorspheres kültürlü olarak kültürlü örnekler; Ancak, bu teknik olarak bir kültür alanlarında büyüyebilir hücre tipleri için sınırlar. Diğer geçiş ve işgal deneyleri kurmak kolay, onlar bir 96-iyi biçimde iş ve zaman içinde ölçülebilir veridir avantajları.

Genel olarak, tedavi sonrası GBM nüks önlemek için soruşturma BTSC geçiş ve işgal kolaylaştırmak metodolojileri geliştirmek esastır. Burada açıklanan geçiş protokolü daha önce kurulan geçiş deneyleri, özellikle GBM BTSCs incelenmesi için birçok avantaj sunar. Bu geliştirilmiş geçiş protokolü neurosphere koşullar altında kültürlü ve tek bir 96-şey kolajen kaplı kemotaksisi geçiş tabak hücrelerde kaplama BTSCs dissociating içerir. Canlı hücre görüntüleme sistemi kullanarak, BTSCs göç izlenmeli ve zaman içinde sayılabilir. Burada açıklanan işgali tahlil bir matris içine neurospheres üzerinden BTSC akınları izlenmesi için izin verir. Bu tahlil neurospheres kollajen matris veya başka bir protein açısından zengin hücre dışı matriks, bir 96-şey tabak içinde katıştırma içerir. Görüntüleme bir canlı hücre zaman hata görüntüleme sistemi ile plaka BTSC akınları farklı tedavi koşullar altında inceleyebilmemiz için zaman içinde sağlar. Bu deneyleri, dolayısıyla, BTSC göç ve işgali altında yatan mekanizmaları daha iyi anlamak için bilim adamları için değerli bir araç sağlar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Rozina Hassam ve Orsolya Cseh onların teknik destek için teşekkür ederiz. Bu araştırma projesi kısmen yeniliklere (H. Artee Luchman ve Samuel Weiss) ve kök hücre ağlar of Canada (Ayrıca için H. Artee Luchman ve Samuel Weiss) için hibe Kanada Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
Matrigel matrix Corning 356230
NaOH VWR BDH3247-1
Acetic Acid Millipore Sigma AX0073-6
96-well plates Eppendorf 30730119
T25 Nunc EasYFlask ThermoFisher 156367
Falcon 15ml conical tube ThermoFisher 352096
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate Essen Bioscience 4582
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System Essen Bioscience 4545
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software Essen Bioscience 2016A Rev1
Accumax cell detachment solution Innovative Cell Technologies AM105
Penicillin, streptomycin  Sigma P4333
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D8537
Culture grade water Lonza BioWhittaker 17-724Q
Fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 12483-020
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  3. Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).
  4. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  5. Galli, R. Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma. Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).
  6. Kelly, J. J. P., et al. Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens. STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).
  7. Cusulin, C., et al. Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes. Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
  8. Luchman, H. A., et al. Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival. Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).
  9. Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model. PLoS ONE. 12 (12), e0189670 (2017).
  10. Nguyen, S. A., et al. Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).
  11. Hemmati, H. D., et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).
  12. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  13. Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. BBA – Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).
  14. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  15. Albini, A., et al. A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
  16. Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  17. Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).

Tags

Live-cell ImagingGlioblastomaBrain Tumor Stem Cells (BTSCs)MigrationInvasionCancer Stem CellsCell CultureNeurosphereCell DetachmentChemotaxisDrug Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C., Weiss, S., Luchman, H. A. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. J. Vis. Exp. (138), e58152, doi:10.3791/58152 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image