JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Published: August 29, 2018
doi:
10.3791/58152
, , , ,
1Hotchkiss Brain Institute, Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology Program, Arthur and Sonia Labatt Brain Tumor Research Centre,The Hospital for Sick Children

Summary

Hier beschrijven we live-cel beeldvormingstechnieken voor het kwantitatief meten van de migratie en invasie van de cellen van de stam van tumor van de hersenen van glioblastoma na verloop van tijd en onder meerdere behandeling voorwaarden.

Abstract

Glioblastoma (GBM) is een agressieve hersentumor die slecht wordt beheerd met de momenteel beschikbare behandelingsopties. Belangrijkste kenmerken van GBMs zijn snelle verspreiding en doordringende invasie in de normale hersenen. Herhaling wordt beschouwd als gevolg van de aanwezigheid van radio – en chemo-resistant hersenen tumor stamcellen (BTSCs) die uit de buurt van de eerste kanker massa binnenvallen en, dus, het onttrekken van chirurgische resectie. Vandaar, therapieën die gericht zijn op BTSCs en hun invasieve capaciteiten kunnen verbeteren het anders slechte prognose van deze ziekte. Onze fractie en anderen hebben met succes vastgesteld en gekenmerkt BTSC culturen van GBM-patiënten monsters. Deze BTSC culturen aantonen fundamentele Kanker stamcel eigenschappen zoals clonogenic self-renewal, multi lineage differentiatie en tumor inleiding bij immuun-deficiënte muizen. Om te verbeteren op de huidige therapeutische benaderingen voor GBM, is het nodig een beter inzicht in de mechanismen van BTSC migratie en invasie. In GBM is de studie van migratie en invasie beperkt, gedeeltelijk als gevolg van de beperkingen van de bestaande technieken die geen volledig rekening met de kenmerken van groei in vitro van BTSCs gegroeid als neurospheres. Hier beschrijven we snelle en kwantitatieve live-cel imaging tests om te studeren zowel de migratie en invasie eigenschappen van BTSCs. De eerste methode beschreven is de BTSC migratie bepaling die de migratie naar een chemoattractant verloop meet. De tweede methode beschreven is de BTSC invasie bepaling welke beelden en kwantificeert een cellulaire invasie van neurospheres in een matrix. De hier beschreven tests worden gebruikt voor de kwantificering van BTSC migratie en invasie na verloop van tijd en omstandigheden van de verschillende behandeling.

Introduction

Glioblastoma (GBM) is de meest voorkomende en agressieve vorm van hersenkanker en, ondanks de huidige therapie waarbij chirurgische resectie gevolgd door straling en chemotherapie, de mediane overleving van patiënten is een loutere 15 maanden1. GBM is invasieve, zeer resistente en uiteindelijk, een ongeneeslijke ziekte die vereist voortgezet onderzoek in haar inherente biologie teneinde nieuwe therapeutische mogelijkheden. Het hoge sterftecijfer van GBM-patiënten wordt voornamelijk veroorzaakt door de uitgebreide cellulaire invasie in aangrenzende normale hersenweefsel en de migratie langs bloedvaten, die leidt tot een herhaling van de ziekte na behandeling2,3 . Een subset van cellen, hersenen tumor stamcellen (BTSCs), die langzaam fietsen en therapeutisch bestendig, genoemd hebben zijn veronderstelde om te leiden tot een herhaling van de ziekte. GBM BTSCs beeldschermeigenschappen van clonogenic zelf-vernieuwing, multipotent en initiëren van tumor potentiële4,5,6. BTSCs behouden ook de fenotypische, genetische en moleculaire heterogeniteit van hun bovenliggende GBM tumoren7,8,9,10. Deze eigenschappen maken de BTSCs een nuttig modelsysteem voor de studie van GBM en voor het verkennen van nieuwe therapeutische strategieën. In vivo, deze cellen van de stam-achtige staat tumor vorming, groei en invasie wanneer de hersenen van neonatale ratten11 ingeplant zijn en nietzwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immuundeficiëntie (knik/SCID) muizen4. Het vermogen van BTSCs om herhaaldelijk invasieve tumoren in vivo die de cellulaire en histologische kenmerken van hun oorspronkelijke tumoren sterk recapituleren ondersteunt hun rol als inleiding van tumor cellen12.

Nieuwe therapeutische benaderingen zijn ontwikkeld naar doel BTSCs en helpen bij het verbeteren van het lange termijn resultaat voor GBM-patiënten. Momenteel, is er beperkte begrip van de cellulaire processen van migratie en invasie die gekoppeld aan therapeutische weerstand en herhaling zijn. Migratie en invasie zijn verschillende verschijnselen; migratie is het proces ten grondslag liggen aan het geleide verkeer van cellen en houdt de reorganisatie van het cytoskelet, celadhesie-moleculen en montage/demontage van focal contactpunten, overwegende dat invasie ook de fysieke vernietiging van belemmeringen zoals een extracellulaire matrix13. Een algemeen aanvaarde methode voor het bestuderen van de cel migratie en invasie is de Boyden kamer assay14,15. Voor deze techniek, is een dubbele kamer gevuld met media, met de media in de onderste zaal aangevuld met een chemoattractant. Chemotaxis is geactiveerd met behulp van specifieke groeifactoren of cytokines, of foetale runderserum als een niet-specifieke chemoattractant. Naar aanleiding van het verloop van de chemoattractant, cellen migreren door de poreuze membraan. Aan het eindpunt, kunnen de gemigreerde cellen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd aan de onderkant van het membraan door kleuring met cytologische of fluorescerende kleurstoffen. De Boyden migratie assay kan worden aangepast om een bepaling van de invasie door de poreuze coating filteren met componenten van de extracellulaire matrix zoals type I collageen of een kelder membraan-achtige matrix. Invasieve cellen degraderen van de matrix, doorlopen naar de onderkant van de poreuze filter en kunnen worden gekwantificeerd op een gelijkaardige manier aan de bepaling van de migratie. Andere veelgebruikte migratie testen omvatten de kras wond en cel exclusieve zone13testen. De bepaling van de kras wond wordt uitgevoerd door een gat in een cellulaire enkelgelaagde krabben en observeren van de migratie van de cellen van de rand van de wond tegen denkbaar met regelmatige tussenpozen, totdat de kras is gesloten. In de cel uitsluiting assay, wordt een fysieke barrière gebruikt voor het maken van een cel-vrije zone voorafgaand aan het zaaien van de cellen. De barrière is verwijderd zodra de cellen worden confluente en de migratie van de cellen in de cel-vrije zone is beeld regelmatig16.

Deze eerder vastgestelde tests worden vaak gebruikt voor het bestuderen van de migratie of de invasie van het aanhangend en homogene cel populaties maar pose aanzienlijke nadelen bij de studie van GBM BTSCs of andere heterogene kanker cel populaties. De bepaling van Boyden kamer kan alleen eindpunt metingen versus een kinetische beoordeling van cel verkeer genereren. Een observatie na verloop van tijd is van groot belang voor de meting van BTSC migratie, gezien het feit dat cellen uit verschillende culturen vaak op verschillende tarieven migreren. Als zodanig, de voorwaarden en de timing van de bepaling moet worden geoptimaliseerd voor elk type van cultuur en tijdrovende arbeid vereist voor adequate monsterneming en kwantificering. De uitsluiting van het kras en cel testen zijn niet geschikt voor BTSC culturen zoals, zelfs wanneer BTSCs worden gekweekt onder enkelgelaagde voorwaarden op laminin beklede platen, we hebben gezien dat BTSCs lijken te weerstaan beweging in de open ruimte en liever verblijven sluiten nabijheid van andere cellen. Bovendien vastgesteld deze migratie testen niet toestaan voor de visualisatie en bewaking van de afzonderlijke cellen in een experiment. De controle van afzonderlijke cellen na verloop van tijd is waardevol voor de beoordeling van de migratie in heterogene cel populaties, zoals BTSCs. bijkomende nadelen van de tests van de Boyden kamer, kras en cel-uitsluiting de zone voor BTSC culturen zijn die zij vereisen relatief hoge cel nummers, kan tijdrovend zijn om in te stellen, en ofwel snel equilibreer of hebben niet een chemoattractant verloop. Deze testen zijn als zodanig niet ideaal om te gebruiken voor zeldzame of langzaam groeiende cel populaties of drug screening. Deze testen zijn bovendien niet geschikt voor het meten van een invasie in een driedimensionale (3D)-formaat, dat vooral belangrijk voor BTSCs gegroeid onder neurosphere omstandigheden is.

Hier beschrijven we testen specifiek aangepast voor de observatie en kwantificering van de migratie voor afzonderlijke BTSCs en voor de invasie van GBM BTSCs gekweekt als neurospheres. De eerste bepaling wordt een aanpassing van de Boyden kamer bepaling met behulp van live-cel time-lapse beeldvorming en een chemotaxis migratie plaat voor het meten van de Chemotactische cel migratie13beschreven. Live-cel imaging in een multi goed formaat zorgt voor de visualisatie en kwantificering van cel migratie onder meerdere behandeling voorwaarden. De tweede test hier beschreven is een sferoïde invasie assay13,17, welke maatregelen de invasieve eigenschappen van BTSCs gekweekt onder neurosphere omstandigheden en ingebed in een 3D extracellulaire matrix onder verschillende behandeling voorwaarden. Deze tests zijn over het algemeen veel meer compatibel dan eerder beschreven methoden voor het bestuderen van de eigenschappen van het trekkende en invasieve van heterogene BTSC culturen. Ze bieden ook betere mogelijkheden voor het onderzoek naar nieuwe therapeutische strategieën te richten op zowel migratie en invasie, die aanzienlijk tot de herhaling van de ziekte en de letaliteit bijdragen.

Protocol

1. het kweken van stamcellen van Brain Tumor eerder afgeleid van menselijke Glioblastoma Specimens Opmerking: BTSC culturen werden eerder gevestigd van menselijke GBM patiënt monsters6,7,8,9,10. Ontdooi een flesje van diepgevroren bewaard gebleven BTSCs in een bekerglas van 70% ethanol, geplaatst in een waterbad bij 37 ° C, enkel tot de laatste van het ijs heeft ontdooid. Verdun de ontdooide cellen in 10 mL van de media in een conische tube van 15 mL en de cellen bij 150 relatieve centrifugale kracht (RCF) gedurende 7 minuten centrifugeren.Opmerking: In deze protocollen, volledige media verwijst naar standaard media gebruikt om cultuur BTSCs (eerder beschreven door Kelly et al.) 6, meestal met groeifactoren aanwezig. Media zonder groeifactoren verwijst naar de base media met alle onderdelen, maar zonder enige groeifactoren aangevuld. Gecombineerd van de media en resuspendeer de cellen in 8 mL van de volledige media, de cellen en de media overbrengen in een maatkolf van T25. Na 1 week van kweken onder niet-aanhanger voorwaarden, de kolf dagelijks controleren en aanvulling van de inhoud met 1-2 mL van volledige media, zo nodig, als de media begint om afbrekende of begint te worden zuur zoals aangegeven door een oranje-gele kleur te veranderen. Passage cellen wanneer de neurospheres een diameter van ongeveer 250 μm, meestal tussen 10-14 d (Figuur 1 bereikt).Opmerking: De verdubbeling tijd van BTSC culturen varieert sterk. Neurosphere grootte kan worden gemeten met behulp van een oogbeschadigingen en/of micrometer. Om de passage van BTSCs, de media en neurospheres door de media van het oppervlak van de kolf om alle neurospheres verzamelen en overbrengen naar een conische tube van 15 mL en centrifugeer de buis gedurende 7 minuten op 150 RCF pipetteren te verzamelen.Opmerking: Kolven kunnen worden gecontroleerd onder een microscoop om ervoor te zorgen dat alle neurospheres zijn verzameld. Een extra wassen met 5 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of media kunnen worden uitgevoerd voor het verzamelen van alle resterende neurospheres als dit nodig is. Om zich te distantiëren van de BTSC neurospheres in afzonderlijke cellen, de media gecombineerd en voeg 1 mL voorverwarmde cell detachement oplossing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 7 minuten Triturate de BTSC vering 40 x met een P1, 000 micropipet ingesteld op 800 μL.Opmerking: Cellen kunnen worden geïncubeerd langer bij 37 ° C als de neurospheres doen niet distantiëren. Voeg 5 mL PBS (met de antibiotica penicilline en streptomycine) tot de gedissocieerde BTSCs samen en centrifugeer de cellen bij 150 RCF gedurende 7 minuten. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de BTSCs in 1-4 mL van volledige media, afhankelijk van de grootte van de cel-pellet.Opmerking: De celsuspensie moet verder worden verdund, indien de concentratie voorbij de limiet van de nauwkeurige detectie voor het tellen van de nauwkeurige cel. Met behulp van een kleurstof die dode cellen uitsluit, zoals blauwe trypan, het aantal levensvatbare cellen en zaad van de BTSCs in de kolf of plaat van belang — meestal 200.000-300.000 cellen in 8 mL voor volledige media in een maatkolf van T25. 2. brain Tumor stamcel migratie Assay Zaad 200.000 cellen in een maatkolf van T25 in 8 mL volledige media 1-2 weken voordat u een migratie-assay.Opmerking: De tijd tussen plating en uitvoeren van de bepaling zal variëren afhankelijk van het groeitempo op jaarbasis van de cultuur van de BTSC gebruikt. Als u wilt testen van het effect van een drugsbehandeling over migratie, voorbehandeling de cellen met het juiste voertuig, zoals DMSO en drugs van belang door toepasselijke volumes van het voertuig of drug voorraad rechtstreeks in aparte putjes van media met de cellen toe te voegen. De chemotaxis migratie plaat (figuur 2A) voor te bereiden door het coating met een dun laagje van collageen. Bereken het aantal wells van een 96-Wells chemotaxis plaat die moet worden bedekt met collageen. Het opnemen van ten minste drie replicaat putten voor elke voorwaarde. 5 mg/mL verdund van voorraad van controletype I collageen tot 0,2 mg/mL in zuivere azijnzuur verdund tot 0,14 procent in cultuur rang water. Pipetteer 0,2 mg/mL collageen aan zowel de membraan invoegen putten en de onderste reservoir putten die worden gebruikt.Opmerking: De reservoirs van de onderkant van de plaat vereisen 225 µL en de membraan invoegen putten 75 µL van collageen voor een juiste coating. Plaats de plaat van de migratie in een incubator bij 37 ° C voor 1 h. gecombineerd de collageen-oplossing de putjes zonder krassen van de collageen-coating. Was de putjes goed 2 x met steriele 1 x PBS. Als de plaat niet meteen wordt gebruikt, de PBS gecombineerd en sla het bij 4 ° C voor maximaal 2 weken. Warme voorafgaand aan het gebruik, de chemotaxis migratie plaat tot kamertemperatuur. Het onderste reservoir van de chemotaxis migratie plaat voor te bereiden. Pipetteer 225 µL van media (zonder groeifactoren), aangevuld met 10% FBS als een chemoattractant, aan de onderkant reservoir putjes van de plaat chemotaxis migratie. Plaats het membraan invoegen zachtjes in het onderste reservoir in een hoek te voorkomen dat er bubbels. Plaat de cellen in het membraan van de chemotaxis migratie plaat invoegen. Resuspendeer los BTSCs in de media (zonder groeifactoren) op een celdichtheid van 50.000 cellen/mL. Drugs aan de media toevoegen als beoordeling van migratie tijdens verschillende drug behandelingen. Afwisselend, zaad gelijke aantallen vooraf behandelde cellen en cellen, met behoud van de laatste drug concentratie wanneer plating. Typeplaatje 50 µL van de BTSCs uit 2.4.1 stap in elk putje van de plaat van de migratie onder de voorwaarden van de gewenste behandeling. Beeld de chemotaxis migratie. Plaats de chemotaxis migratie plaat in de live-cel imaging systeem en stel de geautomatiseerde beeldbewerkingssoftware te verwerven van microscopische beelden van de plaat elke 1-2 h voor maximaal 72 h. commerciële software gebruiken (Zie Tabel of Materials), klik met de rechtermuisknop op de tijdlijn en reeks het interval van de scan aan elke 2 h gedurende 24 uur.Opmerking: De tijdsinterval en de totale verstreken tijd zal variëren tussen de BTSC culturen gebruikt; begin met 2 h intervallen voor 72 h totdat ervaring heeft opgedaan met individuele BTSC culturen. Als een geautomatiseerd imaging systeem niet beschikbaar is, dan beelden van het hetzelfde gezichtsveld kunnen handmatig worden verkregen met een microscoop en een camera is aangesloten op de beeldbewerkingssoftware. Zodra de image aquisition voltooid is, krijgen de beelden voor het hele experiment en een definitie van de verwerking met behulp van de software van de analyse die de cellen van de achtergrond van het membraan en de poriën van de migratie (figuur 2B, rode masker) onderscheidt maken . Met behulp van commerciële software (Zie Tabel of Materials), selecteert u een Nieuwe definitie van de verwerking en de mailinstellingen verwerking definitie voor BTSCs naar een zaad drempel van 52, een groeien drempel van 85, aanpassingen van de grootte (pixels) door -1 en een minimumoppervlakte van 200 μm2. De definitie van deze verwerking toepassen op de onderzijde van het membraan. Wijzig deze analyse als het geen nauwkeurig onderscheid cellen van het membraan van de achtergrond maakt. Verzamelen van gegevens als de cel-oppervlakte aan de onderzijde van het membraan voor elk van de drie repliceren putten, die alleen telt de cellen die zijn gemigreerd door de poriën. Grafiek van de migratie van de cellen in μm,2 (gebied van cellen gemigreerd) na verloop van tijd (Figuur 2 C, Figuur 3).Opmerking: Zorg ervoor dat het relatieve aantal cellen vergulde en geteld op de oppervlaktelaag van het membraan op de eerste tijd-punt vergelijkbaar zijn (minder dan 20% variatie in alle putjes) tussen alle behandeling voorwaarden ter voorkoming van eventuele effecten van ongelijke plating. Gegevens verzamelen met behulp van die de commerciële software (Zie Tabel van materialen) kan worden uitgevoerd door de lancering van de definitie van de verwerking gemaakt in stap 2.5.2, op Metrics, te klikken en vervolgens op grafiek/export, en vervolgens op gegevens exporteren . 3. brain Tumor stamcel Neurosphere invasie Assay Zaad 200.000 cellen in 8 mL voor volledige media in een maatkolf van T25 1-2 weken voordat u een invasie assay.Opmerking: De timing van de beplating voor het uitvoeren van de test zal afhangen van het tarief van de verspreiding van de cultuur van de BTSC gebruikt. Voor voorbehandeld cellen, wil de compound van belang de kolf op de gewenste concentratie voor de cursus en vooraf bepaalde tijd voordat de neurospheres zijn klaar om te worden bekleed voor invasie. Wacht tot de gemiddelde neurosphere-grootte ongeveer 150-200 μm is; Dit duurt meestal 7-14 d, afhankelijk van de cultuur van de BTSC wordt gebruikt.Opmerking: Het is typisch voor het observeren van een verdeling van de maten van de bol in de kolf. Tip en zachtjes Meng de kolf met een pipet en zet 500 μL van de neurospheres van de BTSC aan een conische buis van 1,5 mL voor elke behandeling voorwaarde; Dit zal worden gebruikt voor de plaat met drie repliceren putten.Opmerking: Stappen 3.3.1 – 3.3.2 zijn optioneel maar aanbevolen voor het eerste invasie experiment op een nieuwe cultuur van de BTSC. Voorbereiden om te bepalen van de dichtheid van de neurospheres die in de put eindigen zal, een tube 1,5 mL zoals in stap 3.3. Zachtjes Meng van de neurospheres en 100 μl verplaatsen naar een afzonderlijke 96-wells-plaat en laat de neurospheres door de zwaartekracht gedurende 5 minuten bezinken. Controleer zijn het aantal neurospheres onder de Microscoop om meerdere neurospheres in de regio van het goed dat zonder overbevolking het beeld zal worden.Opmerking: Neurospheres van de binnenvallende vereisen voldoende ruimte om te verdrievoudigen in diameter zonder interactie met de naburige neurospheres. Het aantal neurospheres per putje kan worden aangepast door het tellen van het aantal neurospheres per putje en het toevoegen van meer of minder neurospheres uit de T25 kolf aan de 1,5 mL conische buis in stap 3.3. Plaats de buis 1,5 mL kegelvormig met de cellen uit stap 3.3 op ijs en stappen 3.5-3.7 op ijs. Laat de neurospheres regelen door de zwaartekracht naar de onderkant van de conische buis van 1,5 mL voor 5 min en prechill een gelabelde 96-wells-plaat op ijs. Resuspendeer de neurospheres aan de extracellulaire matrix-proteïnen. Bereiden van 500 μL van een 0,4 mg/mL controletype I collageen oplossing op ijs voor elke behandeling voorwaarde: 459 μL van media (zonder groeifactoren), 40 μL van de collageen-stockoplossing van 5 mg/mL en 0,92 μL van steriele 1N toevoegen NaOH (tabel 1).Opmerking: 500 μL van de collageen-oplossing is vereist per behandeling voorwaarde: 100 μl voor elk van de drie repliceren putten en 200 μl van het exces binnen. Drug behandelingen moeten hier worden toegevoegd op de gewenste eindconcentratie, afgetrokken van het onderdeel van de media van de oplossing. Dit protocol beschrijft het gebruik van controletype I collageen als de extracellulaire matrix eiwitten; echter, elke extracellulaire matrix eiwitten kan worden getest. Bovendien, voor BTSC kunnen culturen die lagere tarieven van invasie, groeifactoren of FBS hebben worden aangevuld in de media te verhogen van het tempo van de invasie. Nadat de neurospheres uit stap 3.5 hebben geregeld, gecombineerd als veel van de media mogelijk zonder verlies van de neurosphere pellet die onderaan heeft geregeld. Zachtjes resuspendeer de neurospheres in 500 μL van de collageen-oplossing bereid in stap 3.6.1. Breng 100 μl van het mengsel van collageen en neurosphere in drie repliceren putjes van de 96-wells-plaat op ijs. Laat de neurospheres op ijs gedurende 5 minuten bezinken. De 96-wells-plaat overbrengen in een incubator 37 ° C gedurende 5 minuten te maken voor collageen polymerisatie. Onmiddellijk bereid om het imago van de 96-wells-plaat. Plaats de 96-wells-plaat in de lade van een live-cel imaging systeem of op het podium van een microscoop te verwerven van een afbeelding als een referentie voor de grootte van de neurosphere op het moment van plating, voordat de invasie begint. Verwerven van afbeeldingen elk uur totdat het tempo van de invasie heeft plateaued; Dit gebeurt meestal binnen 24 uur.Opmerking: Het imaging interval kan worden aangepast afhankelijk van de apparatuur wordt gebruikt. De imaging-interval en totaal verstreken tijd kan ook worden gewijzigd voor BTSC culturen die verschillende tarieven van invasie hebben. Bepalen de toenemende oppervlakte van BTSCs, terwijl ze de matrix na verloop van tijd vallen.Opmerking: Het oppervlak van cellen op het moment van plating, berekend als het gemiddelde van drie repliceren wells, moet dergelijke (minder dan 20% variatie in alle putjes) tussen de voorwaarden van de verschillende behandeling om ervoor te zorgen dat de verschillen in de invasie van BTSC zijn niet sterk beïnvloed door het aantal of de grootte van de neurospheres verguld. Voor de live-cel analysesysteem, gebruik van een 10 X doelstelling voor de Beeldacquisitie en vier beelden per putje te verwerven voor de drie wells repliceren. Instellen om te bepalen van de relatieve cel-oppervlakte, weergegeven als het percentage samenvloeiing van de put, een verwerking definitie waarin specifiek de cellen op de achtergrond van de put. Met behulp van commerciële software (Zie Tabel of Materials), selecteert u een nieuwe definitie van de verwerking en de segmentatie aanpassing aan 0.8, het gebied ten minste 300 μm2, en de excentriciteit maximum tot 0,99 instellen. Wijzig deze analyse als het geen nauwkeurig onderscheid cellen van de achtergrond maakt.Opmerking: Als met behulp van andere methoden de invasie van de neurosphere van de afbeelding na verloop van tijd is het aanbevolen om het verkrijgen van meerdere gezichtsveld voor de drie putten na verloop van tijd repliceren. Imaging niet de exacte hetzelfde gezichtsveld op elk interval verhoogt echter de standaardfout van de verzamelde gegevens. Computersoftware kan worden gebruikt om te helpen met het meten van de oppervlakte van de binnenvallende cellen in elke afbeelding. Verzamelen van gegevens als de cel totaal oppervlak (relatief of absoluut) voor elke goed op elk tijdstip en bepalen van het gemiddelde van de drie repliceren putten. Grafiek van de invasie van BTSCs door de toenemende cel gebied na verloop van tijd.Opmerking: De verzameling van gegevens met behulp van commerciële software (Zie Tabel van materialen) kan worden uitgevoerd door de lancering van de definitie van de verwerking gemaakt in stap 3.10.1, te klikken op de Statistiekenen vervolgens op grafiek/export, en vervolgens op gegevens exporteren .

Representative Results

Hier beschrijven we voorbeelden van gegevens die kunnen worden verkregen met behulp van live-cel imaging tests BTSC migratie en invasie te studeren. BTSCs zijn vergulde als afzonderlijke cellen en kunnen worden geteeld als vrij zwevende neurospheres (Figuur 1). We laten zien dat BTSCs kan worden losgekoppeld en verguld in de putten van de membraan invoegen in een chemotaxis migratie plaat die is bedekt met een dun laagje van type I collageen (figuur 2A). Individuele BTSCs worden gelijkmatig verspreid op de bovenkant van de membraan invoegen aan het begin van de test. Over een periode van 24-72 uur, cellen houden aan het membraan bewegen langs de collageen-gecoate oppervlak en migreren door één van de 96 kleine poriën aan de onderzijde van het membraan, naar een chemoattractant in het reservoir goed. Na het markeren van de cellen op de bovenkant van het membraan in de cellen op de bodem van het membraan in het rood, geel en de poriën in het blauw, cellen kunnen worden gezien op de top (gele cel naderen van een blauwe porie) in de porie invoeren en het verlaten van de porie op de bodem (rode cel afrit ING de blauwe porie) (Figuur 3). Nog belangrijker is, kunnen de cellen drug-behandeld en vergulde in de dezelfde chemotaxis migratie plaat als voertuig-behandelde cellen te bestuderen van het effect van therapeutische interventies op BTSC migratie (figuur 2B) zijn. De chemotaxis migratie plaat zorgt voor de beeldvorming van cellen zowel aan de bovenkant en aan de onderkant van de membraan invoegen. Daarom is de kwantificering van cel migratie na verloop van tijd door het tellen van de cellen die zijn gemigreerd naar de onderzijde van het membraan (figuur 2C) mogelijk. We hebben gevonden dat als BTSCs zijn niet volledig losgekoppeld, vervolgens cellen niet via de poriën migreren en als kleine neurospheres (figuur 4A blijven). Het is ook belangrijk om geen plaat meer dan 2.500 BTSCs/goed als dit resulteert in cel samendoen in plaats van migratie naar de onderzijde van het membraan (figuur 4B). Tot slot is het essentieel om te voorkomen dat het maken van de bubbels in het membraan wells invoegen wanneer plating cellen en wanneer het plaatsen van het membraan invoegt op het onderste reservoir, zoals dit voorkomt nauwkeurige beeldvorming en kwantificering (figuur 4C dat). Vervolgens laten we zien dat de BTSC invasie, vanuit neurospheres naar de omliggende matrix, kan worden beeld en gekwantificeerd na verloop van tijd in een indeling van de 96-wells-plaat (figuur 5A). Invasie kan worden gemeten door het kwantificeren van de oppervlakte van de cellen, zoals ze de matrix na verloop van tijd vallen. Met behulp van de software van de analyse van de afbeelding, was de definitie van een verwerking toegepast dat overlays een masker op de cel oppervlakte, waarmee automatische kwantificering na verloop van tijd (figuur 5B). Time-lapse video’s van BTSC invasies kunnen ook worden gemaakt, om eenvoudig observeren het totale proces van BTSC invasie (Figuur 6). Fluorescent microscopie kan daarnaast worden gebruikt naar afbeelding BTSCs die uitdrukking geven aan fluorescerende eiwitten, zoals groen fluorescente proteïne (GFP) of rode fluorescerende eiwit (RFP). Hier hebben we een time-lapse video van BTSCs uiting geven aan een cytosolische vorm van GFP te helpen bijhouden van individuele BTSCs terwijl ze een kelder membraan-achtige matrix (Figuur 7 vallen). Deze BTSC neurosphere invasie assay staat ook voor drug behandelingen te worden toegevoegd in repliceren wells direct beoordelen hun effecten op de BTSC invasie van neurospheres in een matrix (figuur 8A). De kwantificering van meerdere neurospheres in repliceren wells kan worden berekend en worden opgenomen in een grafiek na verloop van tijd te evalueren van het effect van drugs in meerdere concentraties (Figuur 8). Het protocol hierboven beschreven overtreding kan leiden tot een onvermogen om betrouwbare en accurate gegevens te verkrijgen. Inbedding BTSC neurospheres die te groot zijn, leidt met een diameter groter dan 200 µm, tot een vlak van de focus thats te groot is om alle bollen in een gezichtsveld (figuur 8C) nauwkeurig te kwantificeren. Op dezelfde manier kan falen om te handhaven de matrix bij 4 ° C terwijl het insluiten van de neurospheres ook leiden tot bollen die niet op hetzelfde vlak van focus en een extracellulaire matrix die heeft niet gestold gelijkmatig, waardoor het verzamelen van nauwkeurige gegevens (figuur 8D ). Figuur 1: kweken BTSCs. Deze panelen zijn een representatief voorbeeld van BTSCs gegroeid van afzonderlijke cellen tot neurospheres over de periode van een 14-d in cultuur. De hier getoonde op dag 14 neurospheres zijn van een passende omvang voor passaging. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: Live-cel beeldvorming van de migratie van een BTSC. (A) Dit is een voorbeeld van een 96-Wells chemotaxis migratie plaat bekleed met een dun laagje van type I collageen voorafgaand aan het uitvoeren van de bepaling van de migratie met BTSCs. De afbeeldingen tonen i) een bord met alle drie delen (deksel, membraan invoegen en reservoir) geplaatst samen, ii) alle drie delen gescheiden, iii) een close-up foto van het bovenaanzicht van de membraan insert, iv) een close-up beeld van de onderste weergave van de membraan-insert en v) een close-up beeld van het onderste reservoir. (B) Dit zijn representatieve beelden van een migratie van de BTSC aan het begin (0 h) van het experiment en bij 24 h. Beeld richt zich op de bovenkant van de membraan invoegen waarin de cellen werden oorspronkelijk verguld. Cellen die naar de onderkant van de chemotaxis migratie plaat hebt gemigreerd zijn rood gemarkeerd. Bij 0 h, hebt een paar cellen gemigreerd naar de onderzijde van het membraan. Na 24 h, het aantal gemigreerde cellen dramatisch gestegen. De vergelijking van de beelden op 24u voor cellen die zijn behandeld met een voertuig vs. drug X toont aan dat de medicamenteuze behandeling BTSC migratie vermindert. De schaal bars vertegenwoordigen 600 µm. (C) dit paneel toont de kwantificering van de migratie van een BTSC na voorbehandeling met een voertuig of drug X. De grafiek toont dat de drugsbehandeling een sterk effect op de migratie van BTSCs heeft. De gegevenspunten zijn het gemiddelde van de drie technische repliceren putten, en de foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie (SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Geanimeerde afbeelding 3: BTSC migratie time-lapse video. Deze video toont de migratie van BTSCs met een type I collageen beklede chemotaxis migratie plaat. Cellen op de bovenkant van de membraan invoegen worden benadrukt in geel, cellen die naar de onderkant van de membraan invoegen hebt gemigreerd zijn gemarkeerd in het rood en de poriën in het membraan zijn blauw gemarkeerd. Het vlak van de focus is ingesteld op afbeelding cellen aan de onderzijde van het membraan. De video werd gemaakt met behulp van time-lapse beelden genomen elk uur voor 51 h en gecompileerd 4 frames per seconde. De schaal staaf vertegenwoordigt 200 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) Figuur 4: voorbeelden van fouten in de migratie assay set-up. (A) dit paneel toont een voorbeeld van BTSCs die werden niet volledig losgekoppeld voordat plating op de bovenste membraan invoegen van de chemotaxis migratie plaat. Vanwege de grote omvang van het gebied en de kleine grootte van de poriën van het membraan zijn de cellen niet in staat om te migreren naar het onderste reservoir. (B) dit paneel toont een voorbeeld van een migratie-assay waar teveel cellen werden verguld. Het samendoen van de cellen interfereert met cel migratie en kwantificering schaadt. (C) dit paneel toont een voorbeeld van de vorming van de zeepbel op de membraan invoegen waar BTSCs werden verguld. Bubbels leiden tot slechte beeldkwaliteit en een nauwkeurige kwantificering van migratie te voorkomen. De schaal staven 600 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: BTSC neurosphere invasie assay. Deze panelen tonen een voorbeeld van BTSCs invasie van een neurosphere in een 0,4 mg/mL type I collageen matrix gedurende een periode van 6 uur. (A) fase contrast beelden op elk tijdstip worden hier, (B) weergegeven met de representatieve kwantitatieve masker bedekt, zoals in detail beschreven in het protocol van stap 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6: BTSC neurosphere invasie time-lapse video in type I collageen. Deze video toont een invasie van BTSCs van een neurosphere in een 0,4 mg/mL typ ik collageen matrix (ook weergegeven als stilstaande beelden in figuur 5A). De beelden werden verkregen met behulp van een 10 X doel elk uur voor 12u en 4 frames per seconde worden gecompileerd. De schaal staaf vertegenwoordigt 300 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) Figuur 7: BTSC neurosphere invasie time-lapse video in een kelder membraan-achtige matrix. Deze video toont een invasie van BTSCs, dat uitdrukkelijke cytosolische GFP, van een neurosphere in een kelder membraan-achtige matrix. De beelden werden verkregen met behulp van een 4 X doelstelling om 30 min voor 48 h en werden opgesteld bij 8 beelden per seconde. De schaal staaf vertegenwoordigt 800 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) Figuur 8: BTSC neurosphere invasie assay met behandeling. (A) BTSC neurospheres werden ingesloten in een matrix van de kelder membraan-achtige bereid met voertuig of de aangegeven concentraties van drug X. afbeeldingen werden verworven elk uur; Hier zijn beelden genomen op het tijdstip van plating en na 16 h. De schaal staaf vertegenwoordigt 200 µm. (B) een invasie van BTSCs van neurospheres in de omringende matrix werd gekwantificeerd elk uur, zoals beschreven in stap 3 van de protocol. De gegevenspunten zijn het gemiddelde van de drie technische repliceren putten, en de foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM). (C) dit paneel toont BTSC neurospheres ingebed in type I collageen met een bol die is te groot voor kwantificering. De schaal staaf vertegenwoordigt 300 µm. (D) dit paneel toont BTSC neurospheres ingebed in type I collageen dat niet volledig ingesteld. De schaal staaf vertegenwoordigt 300 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Collageen oplossing voorbereiding Voorraad [collageen] (mg/ml) 5 Finale [collageen] (mg/ml) 0.4 Het aantal putten nodig: 5 Totaalvolume (l) 500 Volume van voorraad collageen (l) 40 Volume van 1N NaOH (l) 0.92 Volume van media (l) 459 Tabel 1: voorbereiding van de 0.4 mg/mL controletype I collageen oplossing. Vermeld zijn de bekende starten en de gewenste eindconcentraties van het type I collageen oplossing. De volumes volstaan om de plaat neurospheres in drie repliceren putten, plus twee voor overmaat, en kunnen bevatten één behandeling voorwaarde, zoals in detail beschreven in het protocol van stap 3.

Discussion

Gezien het feit dat kankercellen actief zijn prolifererende, vormt dit een potentiële technische uitdaging voor de studie van cel migratie. Voor de migratie assay hier beschreven, BTSCs zijn vergulde zonder groeifactoren, die beperkt de proliferatie, en het verloop van de chemoattractant van de plaat chemotaxis doet niet volledig equilibreer gedurende 72 uur. Bovendien, als de cellen worden gecontroleerd met behulp van live-cel imaging na verloop van tijd, kunnen cellen visueel erop worden toegezien wijdverbreide celdeling zich niet voordoet. Voor het welslagen van de bepaling van de migratie is het belangrijk te distantiëren van de neurospheres volledig naar afzonderlijke cellen en nauwkeurig de cel het aantal getallen tellen voordat plating. Plating bollen of plating teveel cellen, wat resulteert in het samendoen, kunt voorkomen dat cellen migreren via de kleine poriën (figuur 4A en 4B). Het is ook belangrijk te voorkomen dat er bubbels wanneer de cellen in de chemotaxis migratie plaat plating of bij het plaatsen van het membraan invoegen op het onderste reservoir. Bubbels kunnen wijzigen van het vlak van de focus en nauwkeurige kwantificering (figuur 4C) voorkomen. De gehele plaat moet worden bedekt met een dun laagje van collageen omdat dit cellen een oppervlak om te navigeren naar de poriën in het slagperk, geeft aangezien deze bepaling cellen om te voldoen vereist aan en vervolgens migreren over een biologisch relevante oppervlak naar de chemoattractant.

Het BTSC migratie protocol beschreven hier voorziet de kinetische beoordeling van afzonderlijke cel migratie, vereisen minder cellen voor het testen van de voorwaarden van de verschillende behandeling in vergelijking met de bestaande protocollen. Dit is belangrijk voor de culturen die heel langzaam, groeien aangezien het moeilijk is om te verzamelen van een groot aantal cellen voor experimenten kan zijn. De lage porie-dichtheid van de chemotaxis migratie plaat zorgt voor een trage evenwichtsinstelling van het verloop van de chemoattractant, groter is dan 72 uur, en effectiever bootst het biologisch proces van Chemotactische migratie over een langere periode van tijd. Het protocol is geoptimaliseerd om een zeer dunne laag van collageen coating op de plaat chemotaxis migratie om ervoor te zorgen dat de bepaling maatregelen migratie en niet invasie. Het vergemakkelijkt ook beeldvorming en de kwantificering van afzonderlijke cellen als ze voldoen aan de matrix van de collageen coating van de membraan invoegen. Een beperking van de techniek is echter dat de kwantificering van de migratie over meerdere putten na verloop van tijd sterk vereenvoudigde en versnelde met behulp van commerciële software (Zie Tabel van materialen). Een opmerkelijke voordeel van de migratie-assay is zoals hier beschreven het brede aanpassingsvermogen van het protocol bij andere celtypes. Het is vooral handig voor het kwantificeren van de Chemotactische migratie van cellijnen die beide langzame groeiende zijn, moeilijk te houden, of te langzaam migreren.

Om te verzekeren het succes van de BTSC invasie test, is het noodzakelijk om te verzamelen van neurospheres voordat ze groter is worden dan 200 µm. grotere bollen een vlak van de focus thats te groot is hebben om consequent image & kwantificeren (figuur 5C). Bovendien, neurospheres kunt beginnen met de klomp en samenvoegen met andere neurospheres. Dit geldt voor de verwerving van nauwkeurige en consistente gegevens. Bovendien, is het essentieel dat de neurospheres zijn toegestaan te vestigen op de bodem van de put, terwijl de collageen nog steeds op het ijs is, om de neurospheres aan zijn beeld in een enkele vlak van de focus (figuur 5D). Ook is het belangrijk dat het collageen volledig instellen zonder te bewegen van de plaat omdat dit de vorming van een zelfs matrix, die ongunstig de kwaliteit van de afbeelding (figuur 5D beïnvloeden kan) kan verstoren. Voor de invasie van BTSC assay hier beschreven, is een van de grote voordelen dat BTSCs gekweekt als neurospheres kunnen worden beoordeeld voor invasie rechtstreeks, zonder de noodzaak om te worden adherently gekweekt. Bovendien kan BTSC neurospheres worden ingebed in de extracellulaire matrix, met behulp van afzonderlijke componenten van de extracellulaire matrix van een bepaald weefsel of met behulp van een mengsel van verkrijgbare kelder membraan. Vermelding van de extracellulaire matrix kan helpen om te identificeren of het testen van specifieke mechanismen van invasie. Bijvoorbeeld, met dit protocol is het mogelijk om te beoordelen van het effect van de doelgerichtheid van de individuele leden van de familie van de metallopeptidase matrix van genen, waarvan bekend is dat het degraderen van specifieke matrix onderdelen. Als alternatief, hoewel dit protocol specifiek voor de BTSC neurospheres is, gegroeid als bollen cellen kunnen worden gebruikt op een soortgelijke manier. Voorbeelden zijn borstkankercellen gekweekt als mammospheres of primaire colorectal kankercellen gekweekt als tumorspheres; Dit beperkt echter de techniek om celtypes die als bollen in een cultuur groeien kan. Andere voordelen van zowel de migratie en invasie tests zijn dat ze gemakkelijk zijn aan opstelling, ze in een 96-Wells-indeling werken en de gegevens kwantificeerbare na verloop van tijd is.

Globaal, om te voorkomen dat nabehandeling GBM herhaling, is het essentieel om te ontwikkelen van methodologieën die vergemakkelijken van het onderzoek van BTSC migratie en invasie. Het protocol van de migratie beschreven hier biedt vele voordelen ten opzichte van de eerder vastgestelde migratie testen, vooral voor de studie van GBM BTSCs. Dit verbeterde migratie-protocol omvat BTSCs gekweekt onder neurosphere omstandigheden en afzonderlijke cellen in een 96-Wells collageen beklede chemotaxis migratie plaat plating distantiëren. Met behulp van een live-cel imaging systeem, kan de migratie van BTSCs worden gecontroleerd en gekwantificeerd na verloop van tijd. De bepaling van de invasie hier beschreven staat voor de monitoring van de invasies van de BTSC van neurospheres in een matrix. Deze bepaling impliceert neurospheres inbedden in een matrix van collageen, of een andere eiwitrijke extracellulaire matrix, in een 96-wells-plaat. Beeldvorming van de plaat met een live-cel time-lapse imaging systeem zorgt voor de analyse van BTSC invasies onder omstandigheden van de verschillende behandeling na verloop van tijd. Deze testen, vandaar, geven een waardevol instrument wetenschappers hoop voor een beter begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de BTSC migratie en invasie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Rozina Hassam en Orsolya Cseh voor hun technische ondersteuning. Dit onderzoeksproject werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Foundation van Canada voor innovatie (naar H. Artee Luchman en Samuel Weiss) en de cel van de stam netwerken van Canada (ook aan H. Artee Luchman en Samuel Weiss).

Materials

Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
Matrigel matrix Corning 356230
NaOH VWR BDH3247-1
Acetic Acid Millipore Sigma AX0073-6
96-well plates Eppendorf 30730119
T25 Nunc EasYFlask ThermoFisher 156367
Falcon 15ml conical tube ThermoFisher 352096
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate Essen Bioscience 4582
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System Essen Bioscience 4545
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software Essen Bioscience 2016A Rev1
Accumax cell detachment solution Innovative Cell Technologies AM105
Penicillin, streptomycin  Sigma P4333
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D8537
Culture grade water Lonza BioWhittaker 17-724Q
Fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 12483-020
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  3. Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).
  4. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  5. Galli, R. Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma. Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).
  6. Kelly, J. J. P., et al. Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens. STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).
  7. Cusulin, C., et al. Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes. Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
  8. Luchman, H. A., et al. Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival. Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).
  9. Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model. PLoS ONE. 12 (12), e0189670 (2017).
  10. Nguyen, S. A., et al. Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).
  11. Hemmati, H. D., et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).
  12. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  13. Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. BBA – Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).
  14. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  15. Albini, A., et al. A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
  16. Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  17. Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).

Tags

Live-cell ImagingGlioblastomaBrain Tumor Stem Cells (BTSCs)MigrationInvasionCancer Stem CellsCell CultureNeurosphereCell DetachmentChemotaxisDrug Treatment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C., Weiss, S., Luchman, H. A. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. J. Vis. Exp. (138), e58152, doi:10.3791/58152 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image