فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو
Summary
هنا، نحن تصف خلية يعيش تقنيات التصوير لقياس كمي الهجرة وغزو جليوبلاستوما الدماغ ورم الخلايا الجذعية على مر الزمن وظروف العلاج متعددة.
Abstract
جليوبلاستوما (GBM) هو ورم الدماغ عدوانية التي تسيطر سيئة مع خيارات العلاج المتاحة حاليا. وتشمل الملامح الرئيسية جبمس الانتشار السريع وغزو منتشرة في الدماغ العادي. ويعتقد تكرار نتيجة لوجود مقاومة الإذاعة والكيماوي الدماغ ورم الخلايا الجذعية (بتسكس) التي تغزو بعيداً عن الكتلة السرطانية الأولية، وهكذا، التهرب من الاستئصال الجراحي. ومن ثم فقد تحسين العلاجات التي تستهدف بتسكس وقدراتهم الغازية خلاف ذلك سوء التشخيص لهذا المرض. مجموعتنا وغيرها نجحت في المنشأة وتتميز الثقافات بتسك من عينات المرضى GBM. وتبين هذه الثقافات بتسك خصائص الخلية الجذعية السرطان الأساسية مثل التمايز الذاتي تجديد، ونسب متعددة كلونوجينيك، وبدء الورم في الفئران التي تفتقر إلى المناعة. من أجل تحسين النهج العلاجية الحالية للخليج للحاسبات الآلية، من الضروري فهم أفضل لآليات الهجرة بتسك وغزو. في الخليج للحاسبات الآلية، مقيد دراسة الهجرة والغزو، جزئيا، بسبب القيود المفروضة على التقنيات الموجودة التي لا تراعي خصائص النمو في المختبر من بتسكس نمت نيوروسفيريس تماما. هنا، نحن تصف السريع والكمية خلية يعيش فحوصات التصوير لدراسة خصائص كل من الهجرة والغزو من بتسكس. الطريقة الأولى الموصوفة هي المقايسة الهجرة بتسك الذي يقيس الهجرة نحو تدرج تشيمواتراكتانت. الأسلوب الثاني هو موضح المقايسة غزو بتسك الصور التي ويوضحها غزو خلوية من نيوروسفيريس في مصفوفة. وتستخدم الاختبارات الموصوفة هنا للتحديد الكمي للهجرة بتسك والغزو على مر الزمن وفي ظل ظروف معاملة مختلفة.
Introduction
جليوبلاستوما (GBM) هو الشكل الأكثر شيوعاً وعدوانية من سرطان الدماغ، وعلى الرغم من العلاج الحالي تشمل الاستئصال الجراحي متبوعاً بالإشعاع والعلاج الكيميائي، متوسط بقاء المرضى هي مجرد 15 شهرا1. الخليج للحاسبات الآلية الغازية، شديدة المقاومة للأدوية، وفي نهاية المطاف، واصل مرض عضال يتطلب البحث في البيولوجيا الملازمة لها بغية تحديد السبل العلاجية رواية. ارتفاع معدل وفيات مرضى الخليج للحاسبات الآلية هو أساسا بسبب الغزو الخلوية واسعة النطاق في أنسجة المخ الطبيعية المجاورة والهجرة على طول الأوعية الدموية، الأمر الذي يؤدي إلى تكرار المرض بعد العلاج2،3 . مجموعة فرعية خلايا، ووصف الدماغ ورم الخلايا الجذعية (بتسكس)، التي بطيئة مقاومة علاجية، وركوب الدراجات قد تم الافتراض بأن يؤدي إلى تكرار المرض. الخليج للحاسبات الآلية بتسكس عرض خصائص التجديد الذاتي كلونوجينيك، مولتيبوتينسي، وبدء الورم المحتملة4،،من56. كما تحتفظ بتسكس التغايرية الوراثية والجزيئية والمظهرية للوالدين GBM الأورام7،،من89،10. هذه الخصائص تجعل بتسكس نظام نموذج مفيد للغاية لدراسة الخليج للحاسبات الآلية واستكشاف استراتيجيات علاجية جديدة. في فيفو، هذه الخلايا الجذعية مثل قادرة على تشكيل الورم والنمو وغزو عند زرعها في أدمغة الفئران حديثي الولادة11 والسكري غير السمنة/شديدة مجتمعة الفئران المناعة (موافقة/مشمولان)4. قدرة بتسكس مرارا تشكيل الأورام الغازية في فيفو بإيجاز خصائص الهاتف الخلوي والنسيجي الأورام الأصلي بقوة تدعم دورها كالشروع في ورم الخلايا12.
يجري استهداف بتسكس رواية النهج العلاجية والمساعدة في تحسين نتائج طويلة الأمد لمرضى الخليج للحاسبات الآلية. حاليا، هناك محدودية فهم عمليات الهجرة وغزو الخلوية المرتبطة بالمقاومة العلاجية والتكرار. الهجرة وغزو ظواهر متميزة؛ الهجرة هي العملية الأساسية لتوجيه حركة الخلايا وينطوي على إعادة تنظيم سيتوسكيليتون وجزيئات الالتصاق، والتجميع/التفكيك لمراكز الاتصال، بينما يتطلب الغزو أيضا التدمير المادي للحواجز مثل مصفوفة خارج الخلية13. منهجية مقبولة على نطاق واسع لدراسة الهجرة الخلية والغزو هو ال14،الإنزيم Boyden الدائرة15. لهذا الأسلوب، يتم ملء غرفة مزدوجة مع وسائل الإعلام، مع وسائل الإعلام في الدائرة السفلي وتستكمل مع تشيمواتراكتانت. يتم تشغيل إنزيمية استخدام عوامل النمو محددة أو السيتوكينات، أو الجنين المصل البقري تشيمواتراكتانت غير محددة. وبعد التدرج تشيمواتراكتانت، تهاجر الخلايا عبر غشاء المسامية. في النهاية، يمكن تصور الخلايا التي تم ترحيلها وكمياً في الجزء السفلي من الغشاء بالتلوين بالأصباغ الخلوية أو الفلورسنت. Boyden يمكن تعديل المقايسة الهجرة مقايسة غزو بطلاء مسامية تصفية مع مكونات المصفوفة خارج الخلية مثل نوع أنا الكولاجين أو مصفوفة شبيهة بغشاء الطابق السفلي. الخلايا الغازية تتحلل المصفوفة والتحرك من خلال الجزء السفلي من عامل التصفية المسامية، ويمكن قياسها كمياً بطريقة مماثلة لفحص الهجرة. فحوصات الهجرة شائعة أخرى تشمل الصفر الجرح ومنطقة الاستبعاد خلية فحوصات13. فحص الجرح الصفر يؤديها الخدش فجوة في أحادي الطبقة خلوية ومراقبة هجرة الخلايا من حافة الجرح بالتصوير على فترات منتظمة حتى يتم إغلاق الصفر. في مقايسة الاستبعاد الخلية، يتم استخدام حاجز مادي لإنشاء منطقة خالية من الخلية قبل البذر للخلايا. أن الحاجز هو إزالة مرة واحدة الخلايا المتلاقية وهجرة الخلايا إلى منطقة خالية من الخلية تصويرها بانتظام16.
وهذه المنشأة سابقا كثيرا ما تستخدم معبراً لدراسة الهجرة أو الغزو من السكان خلية ملتصقة ومتجانسة ولكن عيوب كبيرة تشكل عند دراسة بتسكس GBM أو غيرهم من السكان خلية السرطان غير متجانسة. إلا يمكن أن تولد المقايسة الدائرة Boyden نقطة النهاية القياسات مقابل إجراء تقييم حركية لحركة الخلية. ملاحظة على مر الزمن من أهمية عالية بالنسبة لقياس الهجرة بتسك، نظراً لأن خلايا من ثقافات مختلفة وعادة ما تهاجر بمعدلات مختلفة. على هذا النحو، شروط وتوقيت الفحص يجب أن يكون الأمثل لكل نوع من أنواع الثقافة ويتطلب عمالة كثيفة الوقت لأخذ العينات كافية والتحديد الكمي. إغلاق استبعاد الصفر وخلية فحوصات ليست مناسبة تماما للثقافات بتسك كما، حتى عندما تستزرع بتسكس تحت ظروف أحادي الطبقة على لوحات laminin المغلفة، لاحظنا أن بتسكس تظهر مقاومة الحركة في الفضاء المفتوح ويفضل البقاء قرب إلى خلايا أخرى. وعلاوة على ذلك، أنشأت هذه فحوصات الهجرة لا تسمح للتصور ورصد الخلايا الفردية في جميع أنحاء تجربة. رصد الخلايا الفردية على مر الزمن قيماً للتقييم للهجرة في الخلية غير المتجانسة السكان مثل بتسكس. عيوب إضافية Boyden الدائرة والصفر، والخلية-استبعاد المنطقة معبراً للثقافات بتسك التي كانت تتطلب نسبيا أرقام الخلية عالية، يمكن أن تستغرق وقتاً طويلاً لإعداد، وأما سرعة حجته أو ليس لديهم تدرج تشيمواتراكتانت. على هذا النحو، هذه الاختبارات ليست مثالية للاستخدام للسكان خلية نادرة أو بطيئة النمو أو لفحص المخدرات. وعلاوة على ذلك، لا تناسب هذه الاختبارات لقياس غزو في شكل (3D) ثلاثي الأبعاد، وأهمية خاصة بالنسبة بتسكس نمت تحت ظروف نيوروسفيري.
وهنا يصف لنا فحوصات معدلة خصيصا للمراقبة والقياس الكمي للهجرة بتسكس الفردية، وغزو بتسكس GBM مثقف نيوروسفيريس. يصف التحليل الأولى لتكيف من مقايسة الدائرة Boyden استخدام خلية يعيش الوقت الفاصل بين التصوير ولوحة هجرة إنزيمية لقياس الهجرة الخلية تشيموتاكتيك13. تصوير الخلية تعيش في شكل جيد متعدد يسمح للتصور والتقدير الكمي للهجرة الخلية تحت شروط معاملة متعددة. المقايسة الثانية الموصوفة هنا هو كروي غزو مقايسة13،17، ما هي التدابير خصائص بتسكس الغازية مثقف تحت ظروف نيوروسفيري وجزءاً لا يتجزأ في مصفوفة خارج الخلية 3D تحت العلاج المختلفة شروط. عموما، هذه فحوصات متوافقة أكثر بكثير مما سبق وصفها منهجيات دراسة خصائص متغايرة بتسك الثقافات المهاجرة والغازية. كما أنها توفر فرصاً أفضل للتحري عن رواية الاستراتيجيات العلاجية لاستهداف كل من الهجرة والغزو، التي تسهم إلى حد كبير في تكرار المرض والفتك.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظراً لأن الخلايا السرطانية تنتشر بنشاط، وهذا يشكل تحديا تقنية محتملة لدراسة الهجرة الخلية. مقايسة الهجرة المذكورة هنا، هي مطلي بتسكس دون عوامل النمو، مما يحد من الانتشار، والتدرج chemoattractant بليت به لا حجته تماما أكثر من 72 ساعة. وباﻹضافة إلى ذلك، كما يجري رصد الخلايا باستخدام التصوير خلية يعيش مع مرور الوقت، خلايا يمكن بصريا رصد لضمان عدم حدوث انقسام الخلية على نطاق واسع. لنجاح الفحص الهجرة، من المهم أن ننأى نيوروسفيريس تماما للخلايا المفردة ودقة عد الأرقام الخلية قبل الطلاء. تصفيح المجالات أو تصفيح الكثير من الخلايا، مما يؤدي إلى نتائج في التثاقل، منع الخلايا من الهجرة عن طريق المسام الصغيرة (الشكل 4A و 4B). من المهم أيضا تجنب خلق فقاعات عند طلاء الخلايا الموجودة في لوحة الهجرة إنزيمية أو عند وضع إدراج غشاء على قاع الخزان. فقاعات يمكن تغيير الطائرة من التركيز ومنع القياس الكمي الدقيق (الشكل 4). لوحة كاملة يجب أن تكون مغلفة بطبقة رقيقة من الكولاجين لأن هذا يعطي خلايا سطح للتنقل إلى المسام في اللوحة، كما يتطلب هذا الفحص الخلايا على التمسك وثم ترحيل عبر سطح بيولوجيا ذات صلة نحو تشيمواتراكتانت.
يسمح البروتوكول الهجرة بتسك الموصوفة هنا لتقييم حركية الهجرة الخلية الفردية، التي تتطلب عددا أقل من الخلايا لاختبار شروط معاملة مختلفة بالمقارنة مع البروتوكولات القائمة. وهذا مهم للثقافات التي تنمو ببطء شديد، كما أنه يمكن أن يكون من الصعب على جمع عدد كبير من الخلايا للتجريب. كثافة منخفضة المسامية لصفيحة الهجرة إنزيمية يسمح للموازنة أبطأ التدرج تشيمواتراكتانت، أكبر من ح 72، ويحاكي أكثر فعالية العملية البيولوجية للهجرة تشيموتاكتيك على مدى فترة أطول من الزمن. البروتوكول الأمثل أن يكون طبقة رقيقة جداً من طلاء الكولاجين على لوحة إنزيمية الهجرة كفالة أن يكون تحليل تدابير الهجرة ولا غزو. كما يسهل التصوير والتقدير الكمي للخلايا المفردة كما أنها تلتزم بالمصفوفة الكولاجين طلاء إدراج غشاء. واحد الحد من الأسلوب غير أن التحديد الكمي للهجرة عبر آبار متعددة على مر الزمن إلى حد كبير مبسطة وسريعة باستخدام البرمجيات التجارية (انظر الجدول للمواد). ميزة ملحوظة لفحص الهجرة كما هو موضح هنا هو قدرة على التكيف على نطاق واسع من البروتوكول لأنواع الخلايا الأخرى. أنه سوف يكون مفيداً بشكل خاص للتحديد الكمي للهجرة تشيموتاكتيك من خطوط الخلايا التي هي أما بطيئة النمو، صعبة للالتزام، أو ترحيل ببطء.
لضمان النجاح للمقايسة غزو بتسك، من الضروري جمع نيوروسفيريس قبل أن تصبح أكبر من مجالات 200 ميكرومتر. أكبر طائرة تركيز كبير جداً لاستمرار الصورة وتحديدها كمياً (الشكل 5). وعلاوة على ذلك، يمكن أن يبدأ نيوروسفيريس أجمة وتجميعها مع نيوروسفيريس الأخرى. وهذا يؤثر على الحصول على بيانات دقيقة ومتناسقة. وبالإضافة إلى ذلك، من الضروري أن يسمح نيوروسفيريس ليستقر على الجزء السفلي من البئر في حين الكولاجين لا يزال على الجليد، والسماح نيوروسفيريس تصويرها في طائرة واحدة للتركيز (الشكل 5). وبالمثل، من المهم السماح للكولاجين لتعيين تماما دون تحريك اللوحة كهذه يمكن أن تعطل تشكيل مصفوفة حتى، مما قد يؤثر سلبا على جودة الصورة (الشكل 5). للمقايسة غزو بتسك الموصوفة هنا، واحد من أهم مزايا أن بتسكس مثقف نيوروسفيريس يمكن تقييمها للغزو مباشرة، دون الحاجة إلى أن تزرع أدهيرينتلي. وعلاوة على ذلك، يمكن تضمين نيوروسفيريس بتسك في أي مصفوفة خارج الخلية، أما استخدام المكونات الفردية للمصفوفة خارج الخلية من أنسجة محددة أو باستخدام خليط غشاء متاحة تجارياً. يمكن أن تساعد تحديد المصفوفة خارج الخلية لتحديد أو لاختبار آليات محددة للغزو. على سبيل المثال، من الممكن مع هذا البروتوكول، لتقييم أثر استهداف أفراد الأسرة ميتالوبيبتيداسي مصفوفة من الجينات، التي من المعروف أن تتحلل مكونات محددة المصفوفة. بدلاً من ذلك، على الرغم من أن هذا البروتوكول محددة إلى نيوروسفيريس بتسك، أي الخلايا التي نمت كمجالات يمكن استخدامها بطريقة مماثلة. وتشمل الأمثلة خلايا سرطان الثدي المزروعة ماموسفيريس أو خلايا سرطان القولون والمستقيم الابتدائي مثقف تومورسفيريس؛ ومع ذلك، يحد هذا الأسلوب لأنواع الخلايا التي يمكن أن تنمو كمجالات في ثقافة. المزايا الأخرى لفحوصات كل من الهجرة والغزو هي أن تكون سهلة لإعداد وأنها تعمل بشكل جيد 96، والبيانات قابلة للقياس مع مرور الزمن.
إجمالاً، منعا لتكرار العلاج بعد الخليج للحاسبات الآلية، من الضروري وضع منهجيات تيسير التحقيق بتسك الهجرة والغزو. بروتوكول الهجرة الموصوفة هنا يوفر مزايا عديدة أكثر فحوصات الهجرة المتبعة سابقا، لا سيما لدراسة بتسكس GBM. ينطوي هذا البروتوكول الهجرة تحسين الناي بتسكس مثقف تحت ظروف نيوروسفيري وطلاء الخلايا المفردة في صفيحة هجرة إنزيمية المغلفة بالكولاجين 96-جيدا. باستخدام نظام تصوير خلية يعيش، يمكن رصد هجرة بتسكس وكمياً على مر الزمن. والرزن غزو الموصوفة هنا يسمح للرصد لغزوات بتسك من نيوروسفيريس في مصفوفة. هذا التحليل ينطوي على تضمين نيوروسفيريس في مصفوفة الكولاجين، أو آخر المصفوفة خارج الخلية الغنية بالبروتين، في لوحة 96-جيدا. تصوير اللوحة مع خلية يعيش الوقت الفاصل بين نظام تصوير يسمح للتحليل لغزوات بتسك تحت ظروف معاملة مختلفة على مر الزمن. وبالتالي، توفر هذه الاختبارات، أداة قيمة للعلماء أملا في تحسين فهم الآليات الكامنة وراء الهجرة بتسك والغزو.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون روزينا حسام وفواز ثاني لتقديم الدعم التقني لهم. وأيد المنح من “مؤسسة كندا” هذا المشروع البحثي في جزء منه للابتكار (بحاء أرت لاشمان وصمويل فايس) وشبكات الخلايا الجذعية من كندا (أيضا إلى H. أرت لاشمان وصمويل فايس).
Materials
| Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
| NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
| Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
| 96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
| T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
| Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
| Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Galli, R. Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma. Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).
- Kelly, J. J. P., et al. Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens. STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).
- Cusulin, C., et al. Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes. Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Luchman, H. A., et al. Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival. Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).
- Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model. PLoS ONE. 12 (12), e0189670 (2017).
- Nguyen, S. A., et al. Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).
- Hemmati, H. D., et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. BBA – Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Albini, A., et al. A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
- Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
