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Cancer Research

Análisis de imágenes de células vivas para estudio Glioblastoma cerebral Tumor células madre migración y la invasión

Published: August 29, 2018
doi:
10.3791/58152
, , , ,
1Hotchkiss Brain Institute, Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology Program, Arthur and Sonia Labatt Brain Tumor Research Centre,The Hospital for Sick Children

Summary

Aquí, describimos la técnicas de imagen de células vivas para medir cuantitativamente la migración y la invasión de células de glioblastoma cerebral tumor con el tiempo y las condiciones de tratamiento múltiples.

Abstract

Glioblastoma (GBM) es un tumor cerebral agresivo mal controlada con las opciones de tratamiento disponibles en la actualidad. Características clave de GBMs incluyen proliferación rápida y penetrante invasión en el cerebro normal. Repetición se piensa para resultar de la presencia de radio – y quimioterapia-resistente cerebro células madre tumorales (BTSCs) que invaden a la masa cancerosa inicial y, así, evitar la resección quirúrgica. Por lo tanto, terapias BTSCs y su capacidad invasiva pueden mejorar el pronóstico de lo contrario pobre de esta enfermedad. Nuestro grupo y otros han establecido con éxito y caracteriza las culturas BTSC de muestras de pacientes de GBM. Estas culturas BTSC demuestran propiedades de células madre de cáncer fundamentales como clonogenic diferenciación self-renewal, multilineal e iniciación del tumor en ratones inmune deficientes. Para mejorar en los actuales enfoques terapéuticos de GBM, una mejor comprensión de los mecanismos de migración de BTSC y la invasión es necesaria. En GBM, el estudio de la migración y la invasión se limita, en parte, debido a las limitaciones de las técnicas existentes que no tienen en cuenta plenamente las características de crecimiento en vitro de BTSCs crecidos como neuroesferas. Aquí, describimos rápidos y cuantitativos ensayos imágenes de células vivas para estudiar propiedades de la migración y la invasión de BTSCs. El primer método descrito es el ensayo de migración BTSC que mide la migración hacia un gradiente chemoattractant. El segundo método descrito es el ensayo de invasión de BTSC que imágenes y cuantifica una invasión celular de neuroesferas en una matriz. Los ensayos aquí descritos se utilizan para la cuantificación de la migración de BTSC y la invasión en el tiempo y bajo condiciones de tratamiento diferentes.

Introduction

Glioblastoma (GBM) es la forma más común y agresiva de cáncer cerebral, a pesar de la terapia actual que implica resección quirúrgica seguida de radiación y quimioterapia, la supervivencia mediana de pacientes es un mero 15 meses1. GBM es invasivo, altamente resistente a los medicamentos, y en última instancia, una enfermedad incurable que requiere continuar investigando en su biología inherente con el fin de identificar nuevas vías terapéuticas. La alta tasa de mortalidad de los pacientes GBM es causada principalmente por la extensa invasión celular en tejido cerebral normal adyacente y la migración a lo largo de los vasos sanguíneos, lo que conduce a una repetición de la enfermedad después de tratamiento2,3 . Han planteado la hipótesis de un subconjunto de células, denominado cerebro células madre tumorales (BTSCs), que son lentas, ciclismo y resistente a la terapéutica, para llevar a la recurrencia de la enfermedad. GBM BTSCs mostrar las propiedades de clonogenic auto-renovación, multipotencia e iniciadoras del tumor potencial4,5,6. BTSCs también conservar la heterogeneidad genética, molecular y fenotípica de sus padres GBM tumores7,8,9,10. Estas propiedades hacen de BTSCs un sistema modelo muy útil para el estudio de GBM y para explorar nuevas estrategias terapéuticas. In vivo, estas células madre son capaces de la formación del tumor, el crecimiento y la invasión cuando están implantados en los cerebros de ratas neonatales11 y diabético no obeso, grave combinado inmunodeficiencia (NOD/SCID) ratones4. La capacidad de BTSCs para formar varias ocasiones tumores invasivos en vivo que recapitulan las características celulares e histológicas de los tumores originales fuertemente apoya su papel como células iniciadoras del tumor12.

Nuevos enfoques terapéuticos se están desarrollando en destino BTSCs y ayudar a mejorar el resultado a largo plazo para pacientes con GBM. Actualmente, existe limitada comprensión de los procesos de migración y la invasión celulares que se asocian con resistencia terapéutica y repetición. Migración y la invasión son fenómenos distintos; migración es el proceso subyacente al movimiento dirigido de las células y consiste en la reorganización del citoesqueleto, moléculas de adhesión y montaje y desmontaje de los puntos de contacto focal, considerando que la invasión también exige la destrucción física de las barreras como una matriz extracelular13. Una metodología ampliamente aceptada de estudiar invasión y migración de la célula es el compartimiento de Boyden ensayo14,15. Para esta técnica, una doble cámara repleta de medios de comunicación, los medios de comunicación en la cámara inferior con un chemoattractant. Chemotaxis se activa utilizando factores específicos de crecimiento o citoquinas o suero bovino fetal como un chemoattractant inespecífica. Siguiendo el gradiente de la chemoattractant, las células migran a través de la membrana porosa. Al final, las células migradas pueden ser visualizadas y cuantificadas en la parte inferior de la membrana mediante tinción con colorantes fluorescentes o citológicos. Boyden ensayo migración puede modificarse a un ensayo de invasión por la porosidad de la capa filtro con componentes de la matriz extracelular como el tipo de colágeno o una matriz similar a la membrana del sótano. Las células invasoras degradan la matriz, desplazarse a la parte inferior del filtro poroso y pueden cuantificarse de una manera similar para el ensayo de migración. Otros ensayos de migración comúnmente utilizados incluyen el rasguño de la herida y la zona de exclusión de la célula de ensayos13. El ensayo de rayado de la herida se realiza por rayar un boquete en una monocapa celular y observar la migración de células desde el borde de la herida por la proyección de imagen a intervalos regulares hasta que el arañazo se cierra. En el análisis de la exclusión de la célula, se utiliza una barrera física para crear una zona libre de la célula antes de la siembra de las células. La barrera es eliminado una vez que las células son confluentes y la migración de las células en la zona libre de células es reflejada regularmente16.

Estas establecieron previamente ensayos con frecuencia se utilizan para el estudio de la migración o invasión de las poblaciones celulares adherente y homogénea pero plantean considerables desventajas al estudiar GBM BTSCs u otras poblaciones de células cancerosas heterogéneas. El ensayo de compartimiento de Boyden sólo puede generar extremo las mediciones frente a una evaluación cinética de movimiento celular. Una observación en el tiempo es de alta relevancia para la medición de la migración de BTSC, dado que las células de diferentes culturas a menudo migran a diferentes velocidades. Como tal, las condiciones y el momento del ensayo debe ser optimizado para cada tipo de cultivo y requiere mucho tiempo de trabajo para el adecuado muestreo y cuantificación. Cerca de la exclusión cero y célula de ensayos no son adecuados para cultivos BTSC como, aun cuando BTSCs se cultivan bajo condiciones de monocapa en las placas revestidas de laminina, hemos observado que BTSCs parecen resistir el movimiento en el espacio abierto y prefieren permanecer en proximidad a otras células. Además, estas establecieron ensayos de migración no permiten la visualización y seguimiento de las células individuales a lo largo de un experimento. El monitoreo de células individuales en el tiempo es valioso para la evaluación de la migración de poblaciones celulares heterogéneas tales como BTSCs. desventajas adicionales de los Boyden cámara, cero y exclusión celular zona ensayos para culturas BTSC son que se requiere relativamente un número alto de células, puede ser desperdiciador de tiempo configurar y tampoco alcancen rápidamente o que no tienen un gradiente chemoattractant. Como tal, estos ensayos no son ideales para usar para poblaciones celulares raras o crecimiento lento o para la detección de drogas. Además, estos ensayos no son adecuados para la medición de una invasión en un formato tridimensional (3D), es especialmente importante para BTSCs crecidos desarrolló condiciones.

Aquí, describimos ensayos modificados específicamente para la observación y cuantificación de la migración para BTSCs individuales y para la invasión de BTSCs de GBM cultivados como neuroesferas. El primer ensayo describe una adaptación del ensayo de cámara de Boyden, usando proyección de imagen Time-lapse de células vivas y una placa de migración quimiotaxis para medir células quimiotácticas migración13. Imágenes de células vivas en un formato de múltiples bien permite la visualización y cuantificación de la migración de la célula bajo varias condiciones de tratamiento. El segundo ensayo descrito aquí es un esferoide invasión ensayo13,17, que mide las propiedades invasoras de BTSCs cultivan en condiciones de desarrolló y encajan en una matriz extracelular 3D bajo tratamiento varias condiciones. En general, estos ensayos son más compatibles que metodologías previamente descritas para el estudio de las propiedades migratorias e invasoras de culturas heterogéneas de BTSC. También ofrecen mejores oportunidades para la investigación de nuevas estrategias terapéuticas para orientar la migración e invasión, que contribuyen significativamente a la recurrencia de la enfermedad y la letalidad.

Protocol

1. cultivo de células de Tumor cerebral derivado previamente muestras de Glioblastoma humano Nota: Las culturas BTSC fueron establecidas previamente de humano GBM muestras6,7,8,9,10. Descongelar un vial de BTSCs criogénicamente conservados en un vaso de precipitados que contiene etanol al 70%, colocado dentro de un baño de agua a 37 ° C, hasta que el último del hielo descongelado. Diluir las células descongeladas en 10 mL de medio en un tubo cónico de 15 mL y centrifugar las células a 150 fuerza centrífuga relativa (RCF) por 7 minutos.Nota: A través de estos protocolos, medios completo se refiere a medios de comunicación estándar utilizado para cultura BTSCs (previamente descritos por Kelly et al.) 6, por lo general con factores de crecimiento presentes. Los medios de comunicación sin factores de crecimiento se refiere a los medios de comunicación de base con todos los componentes, pero sin los factores de crecimiento suplidos. Aspirar los medios de comunicación, resuspender las células en 8 mL de medio completo y transferencia de las células y los medios de comunicación a un matraz de T25. Después de 1 semana de cultivo bajo condiciones no adherente, monitorear diariamente el frasco y complementar el contenido con 1-2 mL de medio completo según sea necesario, si los medios de comunicación comienza a agotar o empieza a ser ácido tal como se indica por un cambio de color amarillo anaranjado. Células de paso cuando las neuroesferas alcanzan un diámetro de aproximadamente 250 μm, generalmente entre 10-14 d (figura 1).Nota: El tiempo de duplicación de las diferentes culturas BTSC varía ampliamente. Tamaño desarrolló puede medirse con un micrómetro ocular. Para BTSCs de paso, recaudar los medios de comunicación y neuroesferas transfiriendo los medios de comunicación hacia abajo la superficie de la cubeta para recoger todos neuroesferas y transferirlos a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar el tubo durante 7 min a 150 RCF.Nota: Los frascos pueden comprobarse bajo un microscopio para asegurarse de que se han recogido todos neuroesferas. Un lavado adicional con 5 mL de fosfato tampón salino (PBS) o los medios de comunicación se pueden realizar para recoger cualquier resto neuroesferas según sea necesario. Para disociar el BTSC neuroesferas en celdas individuales, aspirar los medios de comunicación y añadir 1 mL de solución de separación celular precalentada e incubar que a 37 ° C por 7 min Triturate el BTSC suspensión 40 x con un P1, 000 micropipeta en 800 μL.Nota: Las células pueden ser incubadas ya a 37 ° C si no disociar las neuroesferas. Añadir 5 mL de PBS (con los antibióticos penicilina y estreptomicina) a las BTSCs disociados y centrifugar las células a RCF 150 por 7 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el BTSCs en 1-4 mL de medio completo, dependiendo del tamaño de la pelotilla de la célula.Nota: La suspensión de células debe de diluirse si la concentración es más allá del límite de detección precisa para el recuento exacto de la célula. Utiliza un tinte que excluye las células muertas, como el azul tripán, contar el número de células viables y las BTSCs de semillas en el frasco o placa de interés, por lo general, las células de 200.000-300.000 en 8 mL de medio completo en un matraz de T25. 2. cerebro Tumor células madre migración ensayo Células de semilla 200.000 en un matraz de T25 en 8 mL de medio completo 1-2 semanas antes de planear para llevar a cabo un análisis de la migración.Nota: El tiempo entre planchas y realizar el análisis variará dependiendo de la tasa de crecimiento de la cultura BTSC utilizada. Para probar el efecto de un tratamiento farmacológico sobre la migración, pretratar las células con el vehículo adecuado, como el DMSO y de la droga de interés mediante la adición de volúmenes aplicables del vehículo o drogas stock directamente en pocillos separados de los medios de comunicación que contiene las células. Preparar la placa de migración quimiotaxis (figura 2A) cubriendo con una fina capa de colágeno. Calcular el número de pocillos de una placa de 96 pocillos quimiotaxis que tendrá que ser cubierto con colágeno. Incluyen al menos tres pozos de replicar para cada condición. Diluir 5 mg/mL de stock de colágeno tipo I a 0,2 mg/mL de ácido acético puro diluido a 0.14% de agua del grado de cultura. Pipeta de 0,2 mg/mL de colágeno para los pozos de inserción de la membrana y los pozos de depósito de fondo que se utilizan.Nota: Los depósitos de la parte inferior de la placa requieren 225 μL y los pozos de inserción de la membrana requieren 75 μl de colágeno para un recubrimiento adecuado. Coloque el plato de la migración en una incubadora a 37 ° C durante 1 h. Aspire la solución de colágeno de los pozos sin rayar la capa de colágeno. Lavar los pocillos 2 x con estéril de 1 x PBS. Si la placa no se utiliza inmediatamente, el PBS de aspirar y almacenar a 4 ° C hasta por 2 semanas. Antes de su uso, calentar la placa de migración quimiotaxis a temperatura ambiente. Preparar el depósito de la parte inferior de la placa de migración quimiotaxis. Con una pipeta 225 μL de medios (sin factores de crecimiento), suplementado con 10% FBS como quimioatractiva para los pozos de depósito de fondo de la placa de migración quimiotaxis. Coloque suavemente la inserción de la membrana en el depósito inferior a un ángulo para evitar la creación de burbujas. Las células de la placa en el inserto de la membrana de la placa de migración quimiotaxis. Resuspender disociado BTSCs en medios de comunicación (sin factores de crecimiento) a una densidad celular de 50.000 células/mL. Añadir medicamentos a los medios de comunicación si evaluar la migración durante los tratamientos con fármacos diferentes. Alternativamente, la semilla igual números de células previamente tratadas y control, manteniendo la concentración de la droga final cuando la galjanoplastia. Placa de 50 μl de las BTSCs de paso 2.4.1 en cada pocillo de la placa de la migración en las condiciones de tratamiento deseado. Imagen de la migración quimiotaxis. Coloque la placa de migración quimiotaxis en el sistema de imágenes de células vivas y configure el software de imágenes automatizado para adquirir imágenes microscópicas de la placa cada 1-2 h para hasta 72 h. usando software comercial (véase Tabla de materiales), clic derecho en el línea de tiempo y sistema el intervalo de exploración a cada 2 h durante 24 h.Nota: El intervalo de tiempo y el tiempo total transcurrido variará entre BTSC culturas utilizadas; arranque con intervalos de 2 h por 72 h hasta que se ha ganado experiencia con culturas individuales BTSC. Si un sistema automatizado de proyección de imagen no está disponible, entonces imágenes del mismo campo de visión pueden ser adquiridos manualmente con un microscopio y una cámara conectada al software de proyección de imagen. Una vez completada la adquisición de la imagen, obtener imágenes de todo el experimento y crear una definición de proceso utilizando el software de análisis que distingue las células del fondo de la membrana y los poros de la migración (figura 2B, máscara roja) . Uso de software comercial (véase Tabla de materiales), seleccione una Nueva definición de proceso y establecer la configuración de la definición de procesamiento de BTSCs a un umbral de semilla de 52, un crecer umbral de 85, ajustes del tamaño (pixeles) por -1 y un área mínima de 200 μm2. Esta definición de procesamiento se aplican a la parte inferior de la membrana. Modificar este análisis si no precisamente distinguir las células de la membrana de fondo. Recopilar datos como la superficie de la célula en la parte inferior de la membrana para cada uno de los tres pozos de replicar, que sólo cuenta las células que han migrado a través de los poros. Ver la migración de las células en el μm2 (zona de células migra) con el tiempo (figura 2 C, figura 3).Nota: Asegúrese de que el número relativo de células plateado y contó con la superficie de la membrana en el primer momento es similar (menos de 20% de variación en todos los pocillos) entre todas las condiciones de tratamiento para evitar los efectos de la galjanoplastia desigual. Colección de datos mediante que el software comercial (véase Tabla de materiales) puede ser ejecutado con el lanzamiento de la definición de proceso creada en el paso 2.5.2, clic en métricas, a continuación, en gráfico de la exportacióny luego en exportación de datos . 3. cerebro Tumor células madre desarrolló análisis de invasión Células de semilla 200.000 en 8 mL de medio completo en un matraz de T25 1-2 semanas antes de planear para llevar a cabo un ensayo de invasión.Nota: La sincronización de la galjanoplastia para realizar el análisis dependerá de la tasa de proliferación de la cultura BTSC utilizada. Para las células pretratadas, agregar el compuesto de interés en el matraz a la concentración deseada para el curso de tiempo predeterminado antes de las neuroesferas están listos para ser revestidos para la invasión. Espere hasta que el tamaño promedio desarrolló es aproximadamente 150-200 μm; Normalmente, esto toma 7-14 d, dependiendo de la cultura BTSC está utilizada.Nota: Es típico observar una distribución de tamaños de esfera en el frasco. Punta suavemente el matraz se mezclan con una pipeta y mover 500 μL de las neuroesferas BTSC a un tubo cónico de 1.5 mL para cada condición de tratamiento; Esto se utilizará para la placa de tres pozos de replicar.Nota: Pasos 3.3.1 – 3.3.2 son opcionales pero se recomienda para el primer experimento de invasión en una nueva cultura BTSC. Para determinar la densidad de las neuroesferas que terminarán en el pozo, preparar un tubo de 1,5 mL como en el paso 3.3. Suavemente mezcle las neuroesferas y mover 100 μL en una placa de 96 pocillos separada y permiten las neuroesferas a asentarse por gravedad durante 5 minutos. Compruebe el número de neuroesferas bajo el microscopio para asegurarse de neuroesferas múltiples en la región del pozo que será reflejada sin lo hacinamiento.Nota: Neuroesferas invasores requieren suficiente espacio para triple de diámetro sin interactuar con los vecinos de neuroesferas. Puede ajustar el número de neuroesferas por bien contando el número de neuroesferas por pozo y añadiendo más o menos neuroesferas del frasco T25 al tubo 1,5 mL cónico en el paso 3.3. Coloque el tubo cónico de 1.5 mL con las células de paso 3.3 en hielo y realizar pasos 3.5-3.7 en hielo. Deje que las neuroesferas asentarse por gravedad a la parte inferior del tubo cónico 1.5 mL por 5 min y prechill una placa de 96 pocillos marcada en el hielo. Resuspender las neuroesferas en la proteína de matriz extracelular. Preparar 500 μL de un 0,4 mg/mL tipo I solución de colágeno en el hielo para cada condición de tratamiento: Añadir 459 μL de medios (sin factores de crecimiento), 40 μL de la solución 5 mg/mL colágeno y 0.92 μL de estéril 1N NaOH (tabla 1).Nota: se requiere la condición de tratamiento, 500 μL de la solución de colágeno: 100 μL de cada uno de los tres pozos de replicar y 200 μL de exceso. Los tratamientos con fármacos hay que agregar aquí a la concentración final deseada, restar el componente de medios de comunicación de la solución. Este protocolo describe el uso de colágeno de tipo I como la proteína de matriz extracelular; sin embargo, se puede probar cualquier proteína de matriz extracelular. Además, BTSC las culturas que tienen tasas más lentas de la invasión, factores de crecimiento o FBS pueden completarse en los medios de comunicación para aumentar la velocidad de invasión. Después de habrán colocado las neuroesferas del paso 3.5, Aspire como gran parte de los medios de comunicación como sea posible sin perder la pelotilla desarrolló que se ha instalado en la parte inferior. Resuspender suavemente las neuroesferas en 500 μL de la solución de colágeno preparada en el paso 3.6.1. Añada 100 μL de la mezcla de colágeno y desarrolló a tres repetidos pocillos de la placa de 96 pozos de hielo. Permita que las neuroesferas a instalarse en hielo durante 5 minutos. Transferir la placa de 96 pocillos a una incubadora de 37 ° C por 5 min permitir la polimerización del colágeno. Prepare inmediatamente a la imagen de la placa de 96 pocillos. Coloque la placa de 96 pocillos en la bandeja de un sistema de imágenes de células vivas o en la etapa de un microscopio para adquirir una imagen como referencia para el tamaño de desarrolló en el momento de la galjanoplastia, antes de que comience la invasión. Adquirir imágenes cada hora hasta que la tasa de invasión ha tocado techo; por lo general, esto ocurre dentro de 24 h.Nota: El intervalo imagen puede modificarse en función del equipo. El tiempo de transcurrido el intervalo y total proyección de imagen pueden modificarse para las culturas BTSC que tienen diferentes tasas de invasión. Determinar el área superficial creciente de BTSCs que invaden la matriz con el tiempo.Nota: La superficie de las células en el momento de la galjanoplastia, calculado como la media de tres pozos de replicación, debe ser similar (menos de 20% de variación en todos los pocillos) entre las condiciones de tratamiento diferente para las diferencias en la invasión de BTSC no son fuertemente afectado por el número o el tamaño de las neuroesferas plateado. Para el sistema de análisis de células vivas, utilice un objetivo de X 10 para la adquisición de la imagen y adquirir cuatro imágenes por pozo para replican de los tres pozos. Para determinar el área superficial relativa celular, representado como la confluencia por ciento del pozo, establecer una definición de proceso que destaca específicamente las células sobre el fondo del pozo. Uso de software comercial (véase Tabla de materiales), seleccione una nueva definición de proceso y establecer el ajuste de la segmentación a 0.8, el área mínimo a 300 μm2y la excentricidad máxima a 0.99. Modificar este análisis si no precisa distinguir las células del fondo.Nota: Si utiliza otros métodos para invasión de desarrolló de imagen con el tiempo, se recomienda obtener múltiples campos de vista para los tres replican pozos con el tiempo. Sin embargo, no la proyección de imagen del campo de visión mismo exacto en cada intervalo se incrementará el error estándar de los datos recogidos. Software de computadora puede utilizarse para ayudar a medir la superficie de las células invasoras en cada imagen. Recoger datos como el área superficial total de la célula (relativo o absoluto) para cada bien en cada momento y determinar el promedio de los tres pozos de replicar. Ver la invasión de BTSCs mediante el trazado de la zona de la célula creciente con el tiempo.Nota: Colección de datos usando software comercial (véase Tabla de materiales) se puede ejecutar con el lanzamiento de la definición de proceso creada en el paso 3.10.1, clic en métricasy luego en el gráfico de la exportación, y en exportación datos .

Representative Results

Aquí, describimos ejemplos de datos que pueden obtenerse usando análisis de imágenes de células vivas para el estudio de la invasión y migración BTSC. BTSCs se platean como las células y puede cultivarse neuroesferas flotante (figura 1). Demostramos que BTSCs pueden ser disociados y plateado en los pozos de la inserción de la membrana en una placa de migración quimiotaxis que es cubierto con una capa fina de tipo I colágeno (figura 2A). BTSCs individuales se dispersan uniformemente en la parte superior de la inserción de la membrana al principio del ensayo. Durante un período de 24-72 h, las células se adhieren a la membrana, moverse a lo largo de la superficie recubierta de colágeno y migran a través de uno de los poros pequeños 96 al lado inferior de la membrana, hacia un chemoattractant en el depósito del bien. Después de destacar las células en la parte superior de la membrana en las células en la parte inferior de la membrana en rojo, amarillo y los poros en azul, las células pueden verse entrando en el poro en la parte superior (celda amarilla acercándose a un poro azul) y salida de los poros en la parte inferior (salida de eritrocitos Ing el poro azul) (figura 3). Importante, las células pueden ser tratados con drogas y plateado en el mismo plato de migración quimiotaxis como células control tratados con vehículo para estudiar el efecto de las intervenciones terapéuticas sobre la migración de BTSC (figura 2B). La placa de migración quimiotaxis permite la proyección de imagen de células en la parte superior y en la parte inferior de la inserción de la membrana. Por lo tanto, la cuantificación de la migración celular en el tiempo es posible contar las células que han emigrado a la parte inferior de la membrana (figura 2). Hemos encontrado que si BTSCs no están completamente disociados, entonces las células no migran a través de los poros y permanecer como pequeño neuroesferas (Figura 4A). Es también importante no placa de más de 2.500 BTSCs/bien como este resulta en agregados sobre la célula en lugar de migración a la parte inferior de la membrana (Figura 4B). Por último, es esencial para evitar hacer burbujas en la membrana Introduzca pozos cuando la galjanoplastia células y cuando inserte el colocar la membrana en el depósito inferior, pues esto evita que la proyección de imagen exacta y cuantificación (figura 4). A continuación, te mostramos que invasión de BTSC, de neuroesferas en la matriz circundante, puede ser reflejada y cuantificada en el tiempo en un formato de placa de 96 pocillos (figura 5A). Invasión puede medirse mediante la cuantificación de la superficie de las células que invaden la matriz con el tiempo. Usando software de análisis de imagen, una definición de proceso se aplicó que recubrimientos una máscara sobre la célula de superficie, que permite la cuantificación automática con el tiempo (figura 5B). Videos Time-lapse de invasiones BTSC pueden también crear, para observar fácilmente el proceso general de invasión del BTSC (figura 6). Además, puede utilizarse microscopia fluorescente a imagen BTSCs que expresan proteínas fluorescentes, como la proteína verde fluorescente (GFP) o proteína fluorescente roja (RFP). Aquí, hemos creado un vídeo Time-lapse de BTSCs expresar de la forma citosólica de la GFP a pista BTSCs individuales como invaden una matriz similar a la membrana basal (figura 7). Este ensayo de invasión BTSC desarrolló también permite tratamientos farmacológicos que se agregará en los pozos de replicar para evaluar directamente sus efectos sobre la invasión de BTSC de neuroesferas en una matriz (figura 8A). La cuantificación de múltiples neuroesferas en replicadas pozos puede ser calculada y graficar en el tiempo para evaluar el efecto de las drogas en varias concentraciones (figura 8B). No seguir el protocolo descrito anteriormente puede conducir a una incapacidad para obtener datos fiables y precisos. Incrustación de neuroesferas BTSC que son demasiado grandes, con un diámetro superior a 200 μm, conduce a un plano de enfoque que es demasiado grande para cuantificar con precisión todas las esferas en un campo de visión (figura 8). Del mismo modo, falta de mantenimiento de la matriz a 4 ° C mientras que la incrustación de las neuroesferas también puede llevar a esferas que no están en el mismo plano de enfoque y una matriz extracelular que no ha solidificado uniformemente, lo que impide la recogida de datos exactos (figura 8 ). Figura 1: cultivo de BTSCs. Estos paneles son un ejemplo representativo de BTSCs crecido de las células a neuroesferas durante 14 d en cultura. Las neuroesferas que se muestra a continuación en el día 14 son de un tamaño apropiado para pases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: imagen de células vivas de una migración de BTSC. (A) este es un ejemplo de una placa de migración Quimiotaxis de 96 pozos recubiertos con una capa fina de tipo colágeno antes de realizar el análisis de la migración con BTSCs. Las imágenes muestran i) una placa con las tres piezas (tapa, inserción de la membrana y depósito) juntarse, ii) las tres partes separadas, iii) una imagen de primer plano de la vista superior de la inserción de la membrana, iv) una imagen de primer plano de la vista de la parte inferior de la inserción de la membrana y v) una imagen de primer plano del embalse inferior. (B) son imágenes representativas de una migración de BTSC al comienzo (0 h) del experimento y a las 24 h. El enfoque de la imagen es en la parte superior de la inserción de la membrana donde originalmente fueron plateadas las células. Las células que han emigrado a la parte inferior de la placa de migración quimiotaxis están resaltadas en rojo. A las 0 h, algunas células han emigrado a la parte inferior de la membrana. Después de 24 h, el número de células migradas ha aumentado dramáticamente. La comparación de las imágenes a las 24 h para las células tratadas con un vehículo vs drogas X demuestra que el tratamiento farmacológico disminuye migración BTSC. La escala barras representan 600 μm. (C) este panel muestra la cuantificación de una migración de BTSC tras tratamiento previo con un vehículo o un medicamento X. El gráfico muestra que el tratamiento farmacológico tiene un fuerte efecto sobre la migración de BTSCs. Los puntos de datos son la media de tres pozos replicadas técnicas, y las barras de error representan la desviación estándar (SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Animada figura 3: vídeo Time-lapse de la migración de BTSC. Este video muestra la migración de BTSCs utilizando un tipo de colágeno recubiertas placa de migración quimiotaxis. Las células en la parte superior de la inserción de la membrana están resaltadas en amarillo, las células que han emigrado a la parte inferior de la inserción de la membrana están resaltadas en rojo y los poros de la membrana son remarcados en azul. El plano de enfoque se establece en las células de la imagen en la parte inferior de la membrana. El video fue creado usando Time-lapse imágenes tomadas cada hora para 51 h y compilado en 4 fotogramas por segundo. La barra de escala representa 200 μm. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar) Figura 4: ejemplos de errores en la configuración del ensayo de migración de. (A) este panel muestra un ejemplo de BTSCs que no fueron completamente disociados antes de galjanoplastia de la cubierta de la membrana superior de la placa de migración quimiotaxis. Debido al gran tamaño de las esferas y el pequeño tamaño de los poros de la membrana, las células son incapaces de migrar el depósito inferior. (B) este panel muestra un ejemplo de un ensayo de migración donde demasiadas células fueron plateadas. La aglutinación de las células interfiere con la migración de la célula y deteriora la cuantificación. (C) este panel muestra un ejemplo de formación de la burbuja de la cubierta de membrana donde BTSCs fueron plateadas. Las burbujas dan lugar a mala imagen calidad y evitar una cuantificación exacta de la migración. Las barras de escala representan 600 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: ensayo de invasión desarrolló BTSC. Estos paneles muestran un ejemplo de BTSCs invadiendo de una desarrolló un tipo de 0,4 mg/mL la matriz de colágeno durante un período de 6 h. Aquí, imágenes de contraste de fase (A) en cada momento aparecen (B) con la máscara cuantitativa representativa overlaid, como se describe en detalle en el paso 3 de protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: BTSC desarrolló invasión Time-lapse video tipo colágeno de I. Este video muestra una invasión de BTSCs de un desarrolló en un 0,4 mg/mL tipo I matriz de colágeno (también se muestra como imágenes fijas en la figura 5A). Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo de X 10 cada hora por 12 h y se compilan a 4 fotogramas por segundo. La barra de escala representa 300 μm. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar) Figura 7: BTSC desarrolló invasión Time-lapse video una matriz similar a la membrana del sótano. Este video muestra una invasión de BTSCs, GFP expreso citosólica, de desarrolló en una matriz similar a la membrana del sótano. Las imágenes fueron adquiridas con un objetivo X 4 cada 30 min durante 48 h y fueron compiladas en 8 fotogramas por segundo. La barra de escala representa 800 μm. por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar) Figura 8: ensayo de invasión BTSC desarrolló con tratamiento. (A) BTSC neuroesferas fueron embebidas en una matriz de la membrana del sótano-como preparada con vehículo o las concentraciones indicadas de droga X. imágenes fueron adquiridas cada hora; se muestra aquí son imágenes tomadas en el momento de la galjanoplastia y después de 16 h. La barra de escala representa 200 μm. (B) una invasión de BTSCs de neuroesferas en la matriz circundante se cuantificó cada hora, como se describe en el paso 3 de protocolo. Los puntos de datos son la media de tres pozos replicadas técnicas, y las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). (C) este panel muestra BTSC neuroesferas incrustado en tipo I colágeno con una esfera que es demasiado grande para la cuantificación. La barra de escala representa 300 μm. (D) este panel muestra BTSC neuroesferas incrustado en el tipo de colágeno que no ha definido completamente. La barra de escala representa 300 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Preparación de solución de colágeno Stock [colágeno] (mg/ml) 5 Final [colágeno] (mg/ml) 0.4 Número de pozos necesitada: 5 Total volumen (μl) 500 Volumen de stock colágeno (μl) 40 Volumen de NaOH 1N (μl) 0,92 Volumen de medios de comunicación (μl) 459 Tabla 1: preparación de 0.4 mg/mL solución de colágeno de tipo I. Figuran a partir de conocido y deseadas concentraciones finales del tipo I solución de colágeno. Los volúmenes mencionados son suficientes para placa neuroesferas en tres pozos de replicar, más dos en exceso y pueden incluir una condición de tratamiento único, como se describe en detalle en el paso 3 de protocolo.

Discussion

Dado que las células cancerosas se multiplican activamente, esto plantea un desafío potencial técnico para el estudio de la migración de la célula. Para el ensayo de migración que se describe aquí, BTSCs se platean sin factores de crecimiento, que limita la proliferación y el gradiente chemoattractant de la placa de quimiotaxis no equilibrar completamente durante 72 horas. Además, como las células están siendo monitoreadas usando proyección de imagen de células vivas con el tiempo, las células pueden visualmente controlarse para asegurar que no se produce división celular generalizada. Para el éxito del ensayo de migración, es importante disociar las neuroesferas totalmente a las células a contar exactamente el número de células antes de la galjanoplastia. Esferas de la galjanoplastia o galjanoplastia demasiadas células, que resulta en la agrupación, puede prevenir las células migren a través de los poros pequeños (Figura 4A y 4B). También es importante evitar crear burbujas cuando las células de la placa de migración Quimiotaxis de la galjanoplastia o al colocar la membrana en el depósito inferior. Burbujas pueden alterar el plano del foco y evitar la cuantificación exacta (figura 4). Toda la placa debe ser cubierta con una fina capa de colágeno porque esto da a las células una superficie para navegar en los poros de la placa, como este análisis requiere que las células se adhieren a y luego migran a través de una superficie biológicamente relevante hacia la chemoattractant.

El protocolo de migración BTSC aquí descrito permite la evaluación cinética de la migración de células individuales, que requieren menos células para condiciones de tratamiento diferentes en comparación con los protocolos de prueba. Esto es importante para los cultivos que crecen muy lentamente, ya que puede ser difícil recoger un gran número de células para la experimentación. La densidad de poro bajo de la placa de migración quimiotaxis permite un equilibrio más lento del chemoattractant degradado, más de 72 h y más eficaz imita el proceso biológico de la migración quimiotáctica sobre un largo periodo de tiempo. El protocolo fue optimizado para tener una capa muy delgada de la capa de colágeno en la placa de migración quimiotaxis para asegurarse de que la migración de las medidas de ensayo y no invasión. También facilita la proyección de imagen y la cuantificación de las células que se adhieren a la matriz de colágeno de la inserción de la membrana de la capa. Sin embargo, una limitación de la técnica es que la cuantificación de la migración a través de pozos múltiples en el tiempo grandemente simplificado y acelerado usando software comercial (véase Tabla de materiales). Una ventaja notable del ensayo de migración como se describe aquí es la amplia adaptabilidad del Protocolo con otros tipos de células. Será especialmente útil para cuantificar la migración quimiotáctica de líneas celulares que son ya sea de crecimiento lento, difícil de adherir, o migrar poco a poco.

Para garantizar el éxito del ensayo de invasión BTSC, es necesario recoger neuroesferas antes de que sean más de 200 μm. esferas más grandes tienen un plano de enfoque que es demasiado grande para la imagen constantemente y cuantificar (figura 5). Además, pueden comenzar neuroesferas a agrupan y agregado con otros neuroesferas. Esto afecta a la adquisición de datos precisas y coherentes. Además, es esencial que las neuroesferas se les permite asentarse en el fondo del pozo, mientras que el colágeno está todavía en el hielo, para permitir que las neuroesferas a ser reflejada en un solo plano del foco (figura 5). Asimismo, es importante permitir que el colágeno fijar completamente sin mover la placa ya que esto puede interrumpir la formación de una matriz incluso, que pueda afectar negativamente a la calidad de la imagen (figura 5). Para el análisis de invasión de BTSC descrito aquí, una de las ventajas principales es que BTSCs cultivadas como neuroesferas pueden evaluarse para invasión directamente, sin la necesidad de cultivarse adherentemente. Además, BTSC neuroesferas pueden ser incrustados en cualquier matriz extracelular, utilizando los componentes individuales de la matriz extracelular de un tejido específico o con una mezcla de membrana basal disponible comercialmente. Especificación de la matriz extracelular puede ayudar a identificar o prueba de mecanismos específicos de la invasión. Por ejemplo, con este protocolo, es posible evaluar el efecto de dirigidos a los miembros individuales de la familia de curación de la matriz de genes, que son conocidos para degradar componentes de la matriz específica. Por otra parte, aunque este protocolo es específico para BTSC neuroesferas, cualquier las células cultivadas como esferas pueden utilizarse de manera similar. Los ejemplos incluyen las células de cáncer de mama cultivadas como esferas o cáncer colorrectal primario células cultivadas como tumorspheres; sin embargo, esto limita la técnica a tipos de células que pueden crecer como esferas de una cultura. Otras ventajas de la migración y la invasión ensayos son que son fáciles de configurar, trabajan en un formato de 96 pozos, y los datos están cuantificables en el tiempo.

En general, para prevenir la repetición de GBM después del tratamiento, es esencial para el desarrollo de metodologías que faciliten la investigación de la migración de BTSC y la invasión. El protocolo de migración aquí descrito ofrece muchas ventajas sobre los ensayos de migración previamente establecido, especialmente para el estudio de BTSCs de GBM. Este protocolo mejora la migración consiste en disociar BTSCs cultivadas bajo condiciones de desarrolló y las células en una placa de 96 pocillos recubiertos de colágeno quimiotaxis migración de la galjanoplastia. Utiliza un sistema de proyección de imagen de células vivas, la migración de BTSCs se puede supervisar y cuantificar en el tiempo. El ensayo de invasión se describe aquí permite el monitoreo de invasiones BTSC de neuroesferas en una matriz. Este análisis implica la incorporación de neuroesferas en una matriz de colágeno, u otra matriz extracelular rica en proteínas, en una placa de 96 pocillos. La proyección de imagen de la placa con un sistema de proyección de imagen de Time-lapse células vivas permite el análisis de las invasiones de BTSC bajo condiciones de tratamiento diferentes con el tiempo. Estos ensayos, por lo tanto, proporcionan una herramienta valiosa a los científicos con la esperanza de comprender mejor los mecanismos subyacentes de la migración de BTSC y la invasión.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen su soporte técnico Rozina Hassam y Orsolya Cseh. Este proyecto de investigación fue apoyado en parte por subvenciones de la Fundación de Canadá para la innovación (H. Artee Luchman y Samuel Weiss) y la redes de células madre de Canadá (también en H. Artee Luchman y Samuel Weiss).

Materials

Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
Matrigel matrix Corning 356230
NaOH VWR BDH3247-1
Acetic Acid Millipore Sigma AX0073-6
96-well plates Eppendorf 30730119
T25 Nunc EasYFlask ThermoFisher 156367
Falcon 15ml conical tube ThermoFisher 352096
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate Essen Bioscience 4582
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System Essen Bioscience 4545
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software Essen Bioscience 2016A Rev1
Accumax cell detachment solution Innovative Cell Technologies AM105
Penicillin, streptomycin  Sigma P4333
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D8537
Culture grade water Lonza BioWhittaker 17-724Q
Fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 12483-020
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Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C., Weiss, S., Luchman, H. A. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. J. Vis. Exp. (138), e58152, doi:10.3791/58152 (2018).
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