住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

1. 脳腫瘍幹細胞の培養ひと膠芽腫標本に由来する以前 注: BTSC 文化は以前人間 GBM 患者サンプル6,7,8,9,10から確立されました。 70% エタノール, 氷の最後は解凍までにちょうど 37 ° c の水浴中に配置を含むビーカーで低温保存 BTSCs のバイアルを解凍します。15 mL コニカル チューブ内のメディアの 10 mL に融解細胞を希釈し、150 相対的な遠心力 (RCF) は 7 分間で細胞を遠心分離します。メモ: これらのプロトコルを通じて完全なメディア文化 (ケリーらによって前述の) BTSCs に使用される標準的なメディアを参照します。6、通常成長因子存在。成長因子なしメディア ベース メディアのすべてのコンポーネントが、補われた任意の成長因子なしを指します。 メディアを吸引、完全なメディアの 8 mL の細胞を再懸濁します、T25 フラスコに電池とメディアを転送します。 非付着性の条件下で培養 1 週間後毎日フラスコを監視し、必要に応じて、メディアを破壊する開始または黄橙色の色の変化で酸性になると始まる場合に 1-2 ml の完全なメディアの内容を補います。通路の細胞、神経幹細胞が約 250 μ m、通常 10-14 d (図 1) の間の直径に到達するとき。注: 異文化 BTSC の倍加時間は異なります。Neurosphere サイズは、眼のマイクロメータを使用して計測できます。 BTSCs を通過するには、メディアを収集し、メディアをピペッティングによる神経幹細胞すべての細胞を収集し、15 mL の円錐管にそれらを転送するためにフラスコの表面をダウンして 150 メーカで 7 分間チューブを遠心分離します。注: フラスコは、すべて神経幹細胞が収集されていることを確認するには顕微鏡下で確認できます。5 ml のリン酸塩の追加洗浄緩衝生理食塩水 (PBS) またはメディアは、必要に応じて任意の残りの神経幹細胞を収集するために実行できます。 単一セル BTSC 神経幹細胞を分離するには、メディアを吸引に予め温めておいた細胞剥離液 1 mL を加えるし、カップ刻んだ P1, 000 ピペット 800 μ L に設定と BTSC 懸濁液 40 x 7 分の 37 ° C で、孵化させなさい。注: セルできる培養もはや 37 ° C で、神経幹細胞が分離を行う場合。 解離の BTSCs に 5 mL の PBS (と抗生物質ペニシリンとストレプトマイシン) を追加し、7 分 150 メーカで細胞を遠心します。 上清を吸引し、細胞ペレットのサイズによっては、完全なメディアの 1-4 mL で、BTSCs を再懸濁します。注: 細胞懸濁液は、濃度が正確な細胞数の正確な検出限界を超える場合さらに希釈する必要があります。 死んだ細胞を含まない染料を使用して、トリパン ブルーなど実行可能なセルの数をカウント、フラスコまたは関心のプレートに、BTSCs をシード-T25 フラスコ内の完全なメディアの 8 mL で通常、200,000-300,000 細胞。 2. 脳腫瘍幹細胞遊走試験 完全なメディア移行分析の実行を計画する前に 1 〜 2 週間の 8 mL の T25 フラスコの種子 200,000 セルします。注: 使用 BTSC 文化の成長率によってめっきと試金の実行の間の時間が異なります。 移行に対する薬物治療の効果をテストするには、セルを含むメディアの別の井戸に直接車または薬のストックの該当するボリュームを追加することによって、DMSO など興味の薬剤の適切な車で細胞を前処理します。 コラーゲンの薄い層でコーティングすることによって、走化性移行プレート (図 2 a) を準備します。 コラーゲンを塗布する必要があります走化性 96 ウェル プレートの井戸の数を計算します。各条件に対して、少なくとも 3 つの複製井戸があります。 株式の 5 mg/mL の希釈における I 型コラーゲン 0.2 mg/mL に純粋な酢酸文化グレード水で 0.14% に希釈します。 膜挿入井戸と下貯水池井戸使用されているコラーゲンの 0.2 mg/mL のピペットします。注: プレートの下部貯水池は 225 μ L を必要とし、膜挿入井戸適切なコーティング用コラーゲン 75 μ L を必要とします。 場所 1 h. の 37 ° C でインキュベーターで移行プレートは、コラーゲン コーティングをスクラッチせず井戸からコラーゲン溶液を吸引します。 2 洗浄滅菌 1x PBS で x。プレートがすぐに使用されていない、PBS を吸引し、2 週間 4 ° C でそれを格納します。使用前に室温に走化性移行プレートを温めます。 走化性移行プレートの下部貯水池を準備します。 10% を添加したメディア (成長因子)、なしの 225 μ L をピペットの走化性移行プレート下部貯水池井戸に走化性因子として FBS。 泡の作成を避けるために斜めに下貯水池に膜挿入をそっと置きます。 膜に細胞の走化性移行プレートの挿入プレート。 50,000 セル/mL の細胞密度でメディア (成長因子) なしで BTSCs を解離再懸濁します。別の薬剤治療中の移行を評価する場合は、メディアに薬を追加します。また、種子めっきとき最終的な薬物濃度を維持しながら前処理細胞および制御の細胞の数と等しい。 所望の治療条件下で移行プレートの各ウェルにステップ 2.4.1 から BTSCs の 50 μ L をプレートします。 走化性移行をイメージします。 生細胞イメージング システムに走化性移行プレートを置き、セット プレートの顕微鏡画像を取得する自動イメージング ソフトウェア最大 72 h 使用して商用ソフトウェアのすべての 1-2 h を (材料の表を参照) を右クリックして、タイムライン、24 h のすべての 2 h にスキャンの間隔を設定します。注: 時間間隔と経過時間の合計、使用 BTSC 文化によって異なります個々 の BTSC 文化経験を積むまで 72 時間 2 h 間隔で開始します。自動画像処理システムが利用できない場合、ビューの同じフィールドの画像は顕微鏡で手動で獲得できます、カメラ、画像処理ソフトウェアに接続されています。 画像の取得が完了したら、実験全体のイメージを取得して膜および移行毛穴 (図 2 b、赤のマスク) の背景から細胞を区別する解析ソフトウェアを使用して処理定義を作成.商用ソフトウェアを使用して (材料の表を参照)、新しい処理定義を選択し、BTSCs の処理定義設定、しきい値を成長サイズの 85、調整の 52 の種子のしきい値に設定(ピクセル)-1、200 μ m2の最小面積で。膜の下側にこの処理定義を適用されます。背景膜から細胞を正確に区別されない場合は、この分析を変更します。 だけ孔を通って移行したセルがカウント 3 つのレプリケート井戸の各膜の下側のセル表面領域としてデータを収集します。2 μ m で細胞の移動をグラフ化 (細胞の面積は移行) (図 2 Cは、図 3) 時間の経過。注: 相対セルめっきし、最初の時点で膜の上面にカウント数が類似していることを確認 (より小さい 20% すべての井戸の間で変動) 不均等なめっきの効果を避けるためにすべての治療条件の間。商用ソフトウェア 2.5.2,グラフ/エクスポート、し、データをエクスポートし、メトリックをクリックする手順で作成された処理定義の起動によって実行される (材料の表を参照) を使用してデータ コレクション. 3. 脳腫瘍幹細胞 Neurosphere 浸潤アッセイ T25 フラスコ浸潤アッセイの実行を計画する前に 1 〜 2 週間の完全なメディアの 8 mL の種子 200,000 セルします。注: めっきから分析を実行するタイミングは、使用 BTSC 文化の増殖率に依存します。 前処理細胞、神経幹細胞は侵入のためにめっきされる準備ができている前に所定の時間のコースのための望ましい集中にフラスコに関心の化合物を追加します。 平均 neurosphere サイズが約 150-200 μ m まで待つ通常、これは 7-14 d は、使用されている BTSC カルチャに応じてかかります。注: それはフラスコ内で球サイズの分布を観察する典型的です。 ヒントし優しくフラスコを混ぜてピペットと BTSC 細胞の 500 μ L を各治療条件の 1.5 mL の円錐管に移動これは 3 つのレプリケート井戸をプレートに使用されます。注: 手順 3.3.1 – 3.3.2、オプションですが新しい BTSC 文化の最初の侵入実験をお勧めします。 井戸に終わる神経幹細胞の密度を決定するには、ステップ 3.3 のように 1.5 mL チューブを準備します。優しく、神経幹細胞をミックスし別 96 ウェル プレートに 100 μ L を移動、5 分のために重力によって解決する神経幹細胞ができます。 それを混雑することがなくイメージングされる井戸の地域で複数の神経幹細胞を確保するために、顕微鏡下で細胞の数を確認します。注: 侵入細胞直径近隣の神経幹細胞とやり取りしなくてもトリプルに十分なスペースが必要です。ウェルあたりの細胞数は、ウェルあたりの細胞数を数える T25 フラスコから 3.3 の手順で 1.5 mL の円錐管にまたはより少ない細胞を追加することによって調整できます。 氷の上ステップ 3.3 からセルで 1.5 mL の円錐管を置き、氷の上の 3.5 3.7 の手順を実行します。 5 分の 1.5 mL の円錐管の下部に重力によって解決し、氷の上のラベルの付いた 96 ウェル プレートを prechill 神経幹細胞ができます。 細胞外マトリックス蛋白質で、細胞を再懸濁します。 準備 500 μ L 0.4 mg/mL のタイプ I のコラーゲン溶液処理条件ごとに氷の上: (成長因子) なしメディアの 459 μ L、5 mg/mL コラーゲン原液 40 μ と 0.92 μ L 滅菌 1N の追加 NaOH (表 1)。注: コラーゲン溶液の 500 μ L は処理条件ごとに必要な: それぞれの 3 つの複製の井戸と過剰の 200 μ L 100 μ L。薬物治療は、ソリューションのメディア コンポーネントから減算、望ましい最終的な集中でここで追加する必要があります。このプロトコルの使用を記述するタイプ I コラーゲン細胞外マトリックス蛋白質;ただし、任意の細胞外マトリックス蛋白質をテストできます。また、BTSC の侵略、成長因子や FBS の遅い率がある文化が侵略の率を高めるためのメディアで補うことが。 ステップ 3.5 から神経幹細胞が落ち着いて後は、下部に収まった neurosphere ペレットを失うことがなく多くの可能なメディアとして吸い出しなさい。優しく 3.6.1 の手順で、コラーゲン溶液の 500 μ L で、神経幹細胞を再懸濁します。 氷の上の 96 ウェル プレートの 3 つの複製井戸にコラーゲンと neurosphere 混合物の 100 μ L を追加します。5 分間氷の上解決する神経幹細胞を許可します。 96 ウェル プレートをコラーゲン重合させる 5 分間 37 ° C の定温器に転送します。 96 ウェル プレートのイメージをすぐに準備します。 96 ウェル プレートをトレイの生細胞イメージング システムやメッキ、侵攻が始まる前に時 neurosphere サイズの参照としてイメージを取得するには顕微鏡のステージ上に配置します。 侵入率が頭打ちになった; まで 1 時間ごとに画像を取得します。通常、これは 24 時間以内に発生します。注: イメージの間隔は、使用されている機器によって変更できます。侵略の頻度が異なる BTSC 文化のイメージングの間隔および合計の経過時間を変更もできます。 彼らは時間の経過とともに行列を侵略 BTSCs の増加の表面領域を決定します。注: 類似する必要がある 3 つのレプリケート井戸の平均として計算されるめっき時にセルの表面の面積 (より小さい 20% すべての井戸の間で変動) BTSC 侵略の違いはないことを確認する別の治療条件の間数またはメッキ神経幹細胞のサイズによって強く影響を受けます。 生細胞解析システム イメージ獲得のため対物レンズ 10 倍を使用し、3 つ複製井戸の井戸あたり 4 つの画像を取得します。まあのパーセントの合流点として表される相対セル面積を決定するには、具体的には井戸の背景の上のセルをハイライト処理定義を設定します。商用ソフトウェアを使用して (材料の表を参照)、新しい処理定義を選択し、0.99 に最大 0.8、300 μ m2、および、偏心する最小の領域に分割調整を設定します。この分析は、背景から細胞を正確に区別されない場合に変更します。注: 時間の経過と共に画像 neurosphere 侵略する他の方法を使用している場合お勧め 3 つが時間の経過とともに井戸を複製用の複数のフィールドの表示を取得します。しかし、ない間隔ごとに正確な同じビュー フィールドを画像収集データの標準誤差が増加します。各画像の侵入細胞の表面積を測定するのに役立ちますコンピューター ソフトウェアを使用できます。 各時点ですべての井戸の表面領域 (相対または絶対) 合計セルとしてデータを収集し、3 つのレプリケート井戸の意味を決定します。時間の経過と共に増加のセル領域をプロットすることによって BTSCs の侵略をグラフ化します。注: データ収集ソフトウェアを用いた 3.10.1、メトリック、グラフ/エクスポート、しをクリックする手順で作成された処理定義を起動して (材料の表を参照) を実行できるし、にデータをエクスポート.