Nous décrivons ici les techniques d’imagerie de cellules vivantes pour mesurer quantitativement la migration et l’invasion du glioblastome cerveau tumeur des cellules souches au fil du temps et dans plusieurs conditions de traitement.
Glioblastome (GBM) est une tumeur au cerveau agressif qui est mal contrôlée avec les options thérapeutiques actuellement disponibles. Principales caractéristiques du GBM comprennent une prolifération rapide et invasion généralisée dans le cerveau normal. Récurrence est censée résulter de la présence de radio-chimio résistant et cerveau cellules souches tumorales (BTSCs) qui envahissent loin la masse cancéreuse initiale et, ainsi, se soustraire à la résection chirurgicale. Par conséquent, thérapies qui ciblent les BTSCs et leurs capacités invasives peuvent améliorer la sinon mauvais pronostic de cette maladie. Notre groupe et autres ont avec succès établi et caractérisé les cultures BTSC d’échantillons de patients de GBM. Ces cultures BTSC démontrent des propriétés de cellules souches cancer fondamentaux comme clonogéniques autorenouvellement, lignées multiples différenciation et initiation tumorale chez des souris immunodéficientes. Afin d’améliorer les approches thérapeutiques actuelles pour GBM, il est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes de migration BTSC et invasion. Dans GBM, l’étude de la migration et l’invasion est limitée, en partie, en raison des limites des techniques existantes qui n’expliquent pas entièrement les caractéristiques de la croissance in vitro de BTSCs cultivés comme neurospheres. Nous décrivons ici rapides et quantitatives cellules vivantes des tests d’imagerie afin d’étudier les propriétés de la migration et l’invasion de BTSCs. La première méthode décrite est le test de migration BTSC qui mesure la migration vers un gradient chimiotactique. La deuxième méthode décrite est le dosage d’invasion BTSC Quelles images et quantifie une invasion cellulaire de neurospheres dans une matrice. Les tests décrits ici sont utilisées pour la quantification du BTSC migration et invasion dans le temps et dans des conditions de traitement différent.
Glioblastome (GBM) est la forme la plus courante et agressive de cancer du cerveau et, malgré le traitement en cours impliquant la résection chirurgicale suivie de radiations et la chimiothérapie, la survie médiane des patients est une peine de 15 mois1. GBM est envahissante, très résistant à la drogue, et en fin de compte, une maladie incurable qui nécessite poursuit des recherches sur sa biologie inhérente afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques. Le taux élevé de mortalité des patients GBM est principalement causé par l’invasion cellulaire étendue dans le tissu cérébral normal adjacent et la migration le long des vaisseaux sanguins, ce qui conduit à une récidive de la maladie après traitement2,3 . Un sous-ensemble de cellules, appelé cerveau tumeur des cellules souches (BTSCs), qui sont lentes, cyclisme et thérapeutiquement résistant, ont émis l’hypothèse pour mener à la récurrence de la maladie. GBM BTSCs afficher les propriétés de clonogéniques autorenouvellement, multipotentialité et déclenchant les tumeur potentiel4,de5,6. BTSCs conservent aussi l’hétérogénéité génétique, moléculaire et phénotypique de leur parent GBM tumeurs7,8,9,10. Ces propriétés font de BTSCs un système modèle extrêmement utile pour l’étude du GBM et pour explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques. In vivo, ces cellules souches sont capables de la formation de tumeurs, la croissance et invasion lorsqu’elles sont implantées dans le cerveau des rats néonatals11 et non obèses diabétiques/sévère combinée d’immunodéficience (NOD/SCID) souris4. La capacité des BTSCs à plusieurs reprises pour former des tumeurs invasives en vivo qui récapitulent les caractéristiques de leurs tumeurs d’originales cellulaires et histologiques fortement prend en charge leur rôle de cellules tumorales qui lance12.
Nouvelles approches thérapeutiques sont en cours d’élaboration pour la cible BTSCs et aident à améliorer les résultats à long terme pour les patients GBM. Il est actuellement limitée à comprendre les processus de migration et invasion cellulaires qui sont associées à la résistance thérapeutique et la répétition. Migration et invasion sont des phénomènes distincts ; la migration est le processus qui sous-tendent le mouvement dirigé des cellules et implique la réorganisation du cytosquelette, molécules d’adhérence et montage/démontage du focales points de contact, alors que l’invasion exige également la destruction physique des barrières comme une matrice extracellulaire13. Une méthodologie largement acceptée d’étudier l’invasion et la migration cellulaire est la chambre de Boyden test14,15. Pour cette technique, une chambre double est remplie avec les médias, avec les médias dans le bas du réservoir additionné d’un facteur chimiotactique. La chimiotaxie est déclenchée à l’aide de sérum de veau fœtal ou cytokines ou des facteurs de croissance spécifiques comme un facteur chimiotactique indéterminé. La suite de la pente de la chemoattractant, cellules migrent à travers la membrane poreuse. Au point de terminaison, les cellules migrés peuvent être visualisés et quantifiées sur la partie inférieure de la membrane par coloration avec colorants cytologiques ou fluorescents. La Boyden, test de migration peut être modifiée pour un dosage d’invasion en enduisant la poreux filtre avec des composants de la matrice extracellulaire tels que type j’ai collagène ou une matrice de type membrane basale. Cellules envahissantes dégradent la matrice, parcourir vers le bas du filtre poreux et peuvent être quantifiés de manière similaire à l’analyse de la migration. Autres essais de migration couramment utilisées incluent le zéro blessure et analyses de la zone d’exclusion de cellule13. L’analyse de la plaie gratter est réalisée en gratter une lacune dans une couche cellulaire et en observant la migration des cellules du bord de la plaie par imagerie à intervalles réguliers jusqu’à ce que le zéro est fermé. Dans l’analyse d’exclusion de cellules, une barrière physique est utilisée pour créer une zone sans cellule avant l’ensemencement des cellules. La barrière est supprimé une fois que les cellules sont confluentes et la migration des cellules dans la zone acellulaire est imagé régulièrement16.
Il a déjà été établie dosages sont fréquemment utilisés pour l’étude de la migration ou l’invasion des populations de cellules adhérentes et homogène, mais pose des désavantages considérables lors de l’étude GBM BTSCs ou autres populations de cellules de cancer hétérogènes. Le dosage de la chambre de Boyden peut générer uniquement endpoint mesures contre une évaluation cinétique du mouvement cellulaire. Une observation au fil du temps est d’une grande pertinence pour la mesure de la migration de BTSC, étant donné que les cellules provenant de cultures différentes migrent souvent à des vitesses différentes. Par conséquent, les conditions et le moment du test doivent être optimisées pour chaque type de culture et nécessite beaucoup de temps de travail d’échantillonnage adéquat et de quantification. L’exclusion de zéro et la cellule dosages ne sont pas bien adaptés aux cultures BTSC que, même lorsque les BTSCs sont cultivées dans des conditions de monocouche sur plaques d’enduit de laminine, nous avons observé que les BTSCs semblent bien résister aux mouvements dans l’espace ouvert et préfèrent rester en étroite proximité à d’autres cellules. En outre, ces établi des essais de migration ne permettent pas pour la visualisation et le contrôle des cellules individuelles dans une expérience. La surveillance des cellules individuelles au fil du temps est précieuse pour l’évaluation de la migration de populations de cellules hétérogènes tels que BTSCs. inconvénients supplémentaires les essais Boyden chambre, aux rayures et cellule-exclusion zone de cultures BTSC sont qu’ils exiger relativement numéros de cellulaire élevée, peut prendre beaucoup de temps à mettre en place, et soit équilibrer rapidement ou n’ont pas un gradient chimiotactique. À ce titre, ces tests ne sont pas idéales à utiliser pour les populations cellulaires rares ou à croissance lente ou pour le dépistage des drogues. En outre, ces tests ne sont pas adaptés pour mesurer une invasion dans un format tridimensionnel (3D), qui est particulièrement important pour BTSCs cultivées dans des conditions Neurosphère.
Nous décrivons ici les essais spécialement modifiés pour l’observation et la quantification de la migration pour BTSCs individuels et pour l’invasion de GBM BTSCs cultivés sous neurospheres. Le premier décrit une adaptation de l’essai de chambre de Boyden en utilisant l’imagerie de cellules vivantes Time-lapse et une plaque de migration de chimiotactisme pour mesurer chimiotactique cell migration13. Imagerie de cellules vivantes dans un format multipuit permet la visualisation et la quantification de la migration cellulaire dans les conditions de traitement multiples. Le deuxième essai décrit ici est un sphéroïde invasion dosage13,17, qui mesure les propriétés invasives des BTSCs cultivées dans des conditions Neurosphère et incorporés dans une matrice extracellulaire 3D sous traitement divers conditions. Dans l’ensemble, ces tests sont bien plus compatibles que la méthodologie décrite précédemment pour étudier les propriétés migratoires et envahissantes des cultures BTSC hétérogènes. Ils offrent également de meilleures possibilités pour la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cibler la migration et invasion, qui contribuent de manière significative à la récurrence de la maladie et la létalité.
Étant donné que les cellules cancéreuses sont multiplient activement, cela pose un défi technique potentiel pour l’étude de la migration cellulaire. Pour le test de migration décrit ici, BTSCs sont plaquées sans facteurs de croissance, qui limite la prolifération et le gradient chimiotactique de la plaque de la chimiotaxie ne pas entièrement équilibrer plus de 72 heures. En outre, comme les cellules sont surveillés en utilisant l’imagerie de cellules vivantes au fil du temps, les cellules peuvent être contrôlés visuellement afin d’assurer la division cellulaire généralisée ne se produit pas. Pour la réussite de l’essai de migration, il est important de dissocier le neurospheres complètement à des cellules individuelles et de compter avec précision le nombre de cellules avant la culture. Sphères de placage ou placage trop de cellules, qui se traduit par agglutination, peut empêcher les cellules de migrer à travers les petits pores (Figure 4 a et 4 b). Il est également important d’éviter de créer des bulles lorsque les cellules de la plaque de migration de chimiotactisme de placage ou lorsque vous placez l’insertion de la membrane sur le réservoir inférieur. Bulles peuvent modifier le plan de mise au point et une quantification précise (Figure 4). La plaque entière doit être recouvert d’une fine couche de collagène parce que cela donne des cellules une surface pour naviguer sur les pores de la plaque, car ce test nécessite de cellules d’adhérer au et puis migrer à travers une surface biologiquement pertinente vers le facteur chimiotactique.
Le protocole de migration BTSC décrit ici permet l’évaluation cinétique de la migration de cellules individuelles, nécessitant moins de cellules pour les essais de traitement différent par rapport aux protocoles existants. Ceci est important pour les cultures qui poussent très lentement, car il peut être difficile de rassembler un grand nombre de cellules pour l’expérimentation. La densité de faible porosité de la plaque de migration de chimiotactisme permet une équilibration plus lente du facteur chimiotactique gradient, plu de 72 h et imite plus efficacement le processus biologique de la migration chimiotactique sur une longue période de temps. Le protocole a été optimisé pour avoir une très fine couche de revêtement de collagène dans l’assiette de migration de chimiotactisme pour s’assurer que le dosage des mesures migration et pas d’invasion. Il facilite également l’imagerie et la quantification des cellules individuelles qu’ils adhèrent à la matrice de collagène, l’insertion de la membrane de revêtement. Cependant, une des limites de la technique sont que la quantification de la migration dans les puits multiples au fil du temps est grandement simplifiée et accélérée à l’aide d’un logiciel commercial (voir Table des matières). Un avantage notable de l’essai de migration telle que décrite ici est la large capacité d’adaptation du protocole pour les autres types de cellules. Il sera particulièrement utile pour quantifier la migration chimiotactique des lignées de cellules qui sont soit à croissance lente, difficile d’adhérer ou de migrer lentement.
Pour assurer le succès du test de l’invasion de BTSC, il est nécessaire de collecter neurospheres avant qu’ils deviennent plus de 200 µm. grandes sphères ont un plan d’action qui est trop grand pour toujours l’image et à quantifier (Figure 5). En outre, neurospheres peut commencer à s’agglutiner et regrouper avec d’autres neurospheres. Ceci affecte l’acquisition des données exactes et cohérentes. En outre, il est essentiel que les neurospheres sont autorisés à s’installer sur le fond du puits, tandis que le collagène est toujours sur la glace, pour permettre le neurospheres à être photographiée sur un seul plan de mise au point (Figure 5). De même, il est important de laisser le collagène définir entièrement sans déplacer la plaque car cela peut perturber la formation d’une même matrice, ce qui pourrait nuire à la qualité de l’image (Figure 5). Pour le dosage d’invasion BTSC décrit ici, un des principaux avantages est que BTSCs cultivés comme neurospheres peuvent être évaluées pour invasion directement, sans avoir besoin d’être cultivées adherently. En outre, BTSC neurospheres peuvent être incorporés dans une matrice extracellulaire, soit à l’aide de différents composants de la matrice extracellulaire d’un tissu spécifique ou un mélange des membranes basales disponibles dans le commerce. Spécifiant la matrice extracellulaire peut aider à identifier ou tester des mécanismes spécifiques de l’invasion. Par exemple, avec ce protocole, il est possible d’évaluer l’effet de viser des membres de la famille de metallopeptidase de matrice de gènes, qui sont connus pour dégrader les constituants de la matrice spécifique. Sinon, même si ce protocole est spécifique à neurospheres BTSC, des cellules cultivées comme des sphères peuvent être utilisés de manière similaire. On peut citer les cellules mammaires cancéreuses cultivées comme mammospheres ou cancer colorectal primitif cellules cultivées comme tumorspheres ; Cependant, ce qui limite la technique pour les types de cellules qui peuvent se développer comme des sphères dans une culture. Autres avantages de la migration et l’invasion des dosages sont qu’ils sont faciles à mettre en place, ils travaillent dans un format 96 puits et les données sont quantifiables au fil du temps.
Dans l’ensemble, afin de prévenir la récurrence de GBM après le traitement, il est essentiel de développer des méthodologies qui facilitent l’enquête de BTSC migration et invasion. Le protocole de migration décrit ici offre de nombreux avantages sur les essais de migration précédemment établies, en particulier pour l’étude des BTSCs de GBM. Le protocole de cette migration améliorés implique dissociant BTSCs cultivées dans des conditions Neurosphère et plaquant des cellules individuelles dans une plaque à 96 puits recouvert collagène chimiotactisme migration. À l’aide d’un système d’imagerie de cellules vivantes, la migration des BTSCs peut être surveillée et quantifiée au fil du temps. Le dosage d’invasion décrit ici permet la surveillance des invasions BTSC de neurospheres dans une matrice. Ce test consiste à intégrer les neurospheres dans une matrice de collagène, ou une autre matrice extracellulaire riche en protéines, dans une plaque à 96 puits. Imagerie de la plaque avec un système d’imagerie Time-lapse de cellules vivantes permet l’analyse des invasions BTSC dans des conditions de traitement différent au fil du temps. Ces tests, par conséquent, fournissent un outil précieux pour les scientifiques dans l’espoir de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent les migrations de BTSC et invasion.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Rozina Hassam et Orsolya Cseh pour leur soutien technique. Ce projet de recherche a été financée en partie par des subventions de la Fondation canadienne pour l’Innovation (pour H. Artee Luchman et Samuel Weiss) et le réseaux de cellules souches du Canada (aussi à H. Artee Luchman et Samuel Weiss).
Rat Collagen I | Trevigen | 3440-100-01 | |
Matrigel matrix | Corning | 356230 | |
NaOH | VWR | BDH3247-1 | |
Acetic Acid | Millipore Sigma | AX0073-6 | |
96-well plates | Eppendorf | 30730119 | |
T25 Nunc EasYFlask | ThermoFisher | 156367 | |
Falcon 15ml conical tube | ThermoFisher | 352096 | |
Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis plate | Essen Bioscience | 4582 | |
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen Bioscience | 4545 | |
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software | Essen Bioscience | 2016A Rev1 | |
Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
Penicillin, streptomycin | Sigma | P4333 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
Culture grade water | Lonza BioWhittaker | 17-724Q | |
Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 12483-020 |