Isolamento e identificação de células do sistema imunológico Extravascular do coração

Diferentes formas de stress do miocárdio ou acidentes, inclusive isquêmica (reperfusão de isquemia ou infarto do miocárdio) e não-isquêmica (hipertensão ou miocardite), promover o recrutamento de células inflamatórias com reparadora e protetora, mas também Propriedades de patogenicidade. Logo em 1891, Romberg descrita pela primeira vez a presença de celulares se infiltra no miocárdio de pacientes infectados com tifo e febre escarlatina¹. No entanto, o estudo detalhado de células do sistema imunológico cardíacas necessária ao desenvolvimento de técnicas mais avançadas de immunophenotyping. Como consequência, somente recentemente nós começaram a entender que uma população diversa de células do sistema imunológico com funções essenciais de manutenção durante o estado estacionário reside dentro do miocárdio.

Histologia tem sido e ainda é, o método mais comum para caracterizar pilhas imunes cardíacas durante a inflamação. No entanto, enquanto histologia representa uma valiosa ferramenta de diagnóstico, sua utilização no estudo de células do sistema imunológico cardíacas tem limitações importantes. As células imunitárias que residem no miocárdio representam uma proporção muito pequena das células totais e são mais ou menos uniformemente distribuídas em um espaço proporcionalmente imenso. Da mesma forma, várias formas de inflamação cardíaca, tais como miocardite viral, apresentam padrões focais de inflamação. Isto significa que uma análise precisa do sistema imunológico do coração muitas vezes exige graus mais elevados de amostragem histológica, aumentando o custo para reduzir o preconceito. Além disso, a histologia fornece uma quantidade muito limitada de informações utilizáveis na identificação de células (por exemplo, o número de parâmetros). Com um número sempre crescente de subconjuntos de célula que exigem o uso de vários marcadores de expressão (incluindo os marcadores de superfície, fatores de transcrição ou moléculas secretadas), citometria de fluxo estabeleceu-se como a ferramenta mais poderosa para immunophenotyping, devido ao baixo custo e alta produtividade.

O uso de técnicas de immunophenotyping é estreitamente dependente do desenvolvimento de protocolos de digestão eficiente que permitiu para análise de single-células de um grande número de células. O desenvolvimento de protocolos exaustivos de extração de célula aberta uma nova janela de oportunidades no estudo da imunologia cardíaca. Através da combinação de digestão, citometria de fluxo e transcriptomics, as grandes populações de macrófagos e células dendríticas, que reside no coração foram caracterizadas^2,3. A população mais abundante de células do sistema imunológico cardíacas durante estado estacionário são CD64⁺MerTK⁺ macrófagos, que podem ser divididos com base na sua expressão de CCR2 ou CD11c². CCR2⁺ macrófagos originam hematopoiese adulta da medula óssea, Considerando que a maioria dos CCR2^– macrófagos, que podem expressar os níveis de altos ou baixos de MHC-II, são principalmente de origem pré-natal. Os macrófagos funções chave como reparo⁴ e remoção de detritos⁵ durante lesão ou suportando conectividade elétrica⁶ em estado estacionário. Durante diferentes formas de inflamação ocorrer um afluxo importante de Ly6C^Oi MHC-II^Eis CD64^int monócitos, que mais tarde se diferenciar em Ly6C^Oi CCR2⁺ macrófagos^2,7 . Uma população significativamente menor, mas importante, de células que residem no miocárdio de indivíduos saudáveis é composta de células dendríticas^8,9. Recentemente foram caracterizados os dois subconjuntos principais de DCs convencionais cardíacas (conjuntos): cDC1 (CD103⁺ DCs) e cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs desempenham um papel importante na defesa contra infecção⁸ mas também podem promover a auto-lesão durante a inflamação, particularmente durante o infarto do miocárdio⁹.

Aqui, descrevemos um método simples para o isolamento das células imunes cardíacas viáveis de miocárdio de rato. O método combina digestão enzimática e mecânica com uma filtração de célula-filtro para obter uma suspensão de célula única que pode ser analisada, ou ainda mais purificada, pela classificação de citometria de fluxo ou enriquecimento magnética do grânulo. Medições precisas de células do miocárdio extravascular necessitam de perfusão cardíaca para remover possíveis contaminantes da corrente sanguínea da microvasculatura cardíaca. Além disso, apresentamos um passo opcional de rotulagem intravascular de células do sistema imunológico que podem ser usadas para diferenciar ainda mais as células do miocárdio de contaminantes intravasculares, com base no protocolo et al Galkina¹⁰. Finalmente, apresentamos uma análise de citometria de fluxo básico para identificar as principais subpopulações de macrófagos e cDC.