Isolierung und Identifizierung von Extravascular Immunzellen des Herzens

Verschiedene Formen der myokardialen Stress oder Verletzungen, einschließlich ischämische (Ischämie Reperfusion oder Myokardinfarkt) und nicht-ischämische (Hypertonie oder Myokarditis), fördern die Einstellung von Entzündungszellen mit reparative und schützend, sondern auch pathogenen Eigenschaften. Bereits im Jahr 1891, beschrieben Romberg erstmals das Vorhandensein von zellulären Infiltrate im Herzmuskel von Patienten mit Typhus und Scharlach¹. Jedoch erforderlich der Detailstudie des kardialen Immunzellen die Entwicklung von fortgeschrittenen Immunphänotypisierung Techniken. Infolgedessen haben wir erst vor kurzem begonnen zu verstehen, dass eine vielfältige Bevölkerung von Immunzellen mit notwendigen Wartungs-Rollen während der Steady-State innerhalb der Herzmuskel befindet.

Histologie wurde und immer noch ist, die am häufigsten verwendete Methode, kardiale Immunzellen während einer Entzündung zu charakterisieren. Während Histologie ein wertvolles diagnostisches Instrument darstellt, hat seine Verwendung in der Studie von kardialen Immunzellen jedoch wichtige Einschränkungen. Die Immunzellen mit Wohnsitz im Myokard stellen einen sehr kleinen Teil der gesamten Zellen und sind mehr oder weniger gleichmäßig verteilt in einem verhältnismäßig großen Raum. Ähnlich, zeigen verschiedene Formen der kardialen Entzündung, wie virale Myokarditis, fokale Muster der Entzündung. Dies bedeutet, dass die genaue Analyse des Immunsystems des Herzens erfordern oft höhere Grade der histologischen Probenahme, Erhöhung der Kosten um Verzerrungen zu reduzieren. Darüber hinaus bietet die Histologie eine sehr begrenzte Menge von brauchbaren Informationen in Zelle Identifikation (z.B. Anzahl der Parameter). Mit einer ständig wachsenden Zahl der Zelle Teilmengen, die mehrere Ausdruck Marker (einschließlich oberflächenmarker, Transkriptionsfaktoren oder abgesondert Moleküle) erfordert, hat sich Durchflusszytometrie als das mächtigste Werkzeug für die Immunphänotypisierung etabliert, aufgrund der Low-Cost und hohem Durchsatz.

Die Immunphänotypisierung Techniken richtet sich eng an der Entwicklung von effizienten Verdauung-Protokolle, die für einzelne Zellen Analyse einer großen Anzahl von Zellen erlaubt. Die Entwicklung der ausführliche Protokolle der Zelle Extraktion eröffnet ein neues Fenster der Möglichkeiten in der Studie von kardialen Immunologie. Durch die Kombination von Verdauung, Durchflusszytometrie und Transkriptom wurden die großen Populationen von Makrophagen und dendritischen Zellen, die ihren Wohnsitz im Herzen zeichnet sich^2,3. Die am häufigsten vorkommende Bevölkerung von kardialen Immunzellen im Steady-State sind CD64⁺⁺ MerTK Makrophagen, die weiter unterteilt werden können, basierend auf ihren Ausdruck CCR2 oder CD11c². CCR2⁺ Makrophagen stammen aus Erwachsenen Knochenmark Hämatopoese, während die Mehrheit des CCR2^– Makrophagen, die hohe oder niedrige Niveaus des MHC-II zum Ausdruck bringen können, sind vor allem pränatalen Ursprungs. Makrophagen führen Sie wichtige Funktionen wie Reparatur⁴ und Entfernung von Schmutz⁵ bei Verletzungen oder elektrische Verbindungstechnik⁶ im Steady-State zu unterstützen. Während verschiedene Formen von Entzündungen ein wichtige Zustrom von Ly6C^Hallo MHC-II^lo CD64^Int Monozyten auftreten, zu unterscheiden, die später in Ly6C^Hallo CCR2⁺ Makrophagen^2,7 . Eine deutlich kleinere, aber wichtige Population von Zellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von gesunden Personen besteht aus dendritischen Zellen^8,9. Die zwei großen Teilmengen von kardialen herkömmlichen DCs (cDCs) wurden vor kurzem charakterisiert: cDC1 (CD103⁺ DCs) und cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs eine wichtige Rolle in der Verteidigung gegen Infektion⁸ aber auch Selbstverletzung während einer Entzündung, besonders bei Myokardinfarkt⁹fördern können.

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Isolierung von lebensfähigen kardiale Immunzellen aus Maus Myokard. Die Methode kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung mit Zelle-Sieb Filtration um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten, die analysiert oder durch Flow Cytometry sortieren oder magnetischer Wulst Bereicherung weiter gereinigt werden können. Genaue Messungen der extravascular Herzmuskelzellen erfordern kardialen Durchblutung um mögliche Verunreinigungen aus dem Blutkreislauf der kardiologische Microvasculature zu entfernen. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen einen optionalen Schritt des intravaskulären Kennzeichnung von Immunzellen, die verwendet werden, um weitere Herzmuskelzellen intravaskulären Verunreinigungen, basierend auf der Galkina Et Al. Protokoll¹⁰unterscheiden. Schließlich präsentieren wir eine grundlegende Flow Cytometry Analyse Ermittlung die wichtigsten Subpopulationen von Makrophagen und cDC.