عزل وتحديد الخلايا المناعية اكسترافاسكولار للقلب
Summary
ويقدم هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وفعالة عزل والتعرف على والتحديد الكمي للخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب الفئران أثناء حالة ثابتة أو التهاب. البروتوكول يجمع الهضم الأنزيمي والميكانيكية لتوليد تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها مزيد من التدفق الخلوي.
Abstract
جهاز المناعة عنصر أساسي لصحة القلب. عضلة القلب موطن لعدد سكان الأغنياء من مجموعات فرعية مختلفة من الخلية المناعية مع التقسيم الوظيفي أثناء حالة ثابتة وأشكال مختلفة من التهاب السواء. حتى وقت قريب، دراسة الخلايا المناعية في القلب المطلوب استخدام الفحص المجهري أو تحديد بروتوكولات المتقدمة سوء الهضم، التي قدمت ما يكفي حساسية أثناء التهاب حاد ولكن لم يتمكنوا من ثقة الصغيرة – لكن الرئيسية – السكان الخلايا أثناء حالة ثابتة. هنا، نحن نناقش أسلوب بسيط الجمع الانزيمية (كولاجيناز والبروتين السكري المثبط الدناز) والهضم الميكانيكي من قلوب مورين يسبقه الإدارة داخل الأوعية المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة التفريق بين الصغيرة ولكن لا مفر منه خلية داخل الأوعية الملوثات. ينشئ هذا الأسلوب تعليق خلايا قابلة للحياة المعزولة التي يمكن تحليلها بواسطة التدفق الخلوي لتحديد الهوية، فينوتيبينج والقياس الكمي، أو تنقية كذلك مع الأسفار تنشيط الخلية فرز أو فصل حبة المغناطيسي النسخي دراسات التحليل أو في المختبر . وندرج مثال لتحليل تدفق خطوة بخطوة سيتوميتريك التفريق بين مفتاح بلعم والسكان الخلايا الجذعية للقلب. لتجربة حجم متوسط (10 قلوب) يتطلب انتهاء الإجراء ح 2 – 3.
Introduction
أشكال مختلفة من احتشاء عضلة القلب من الإجهاد أو الإصابة، بما في ذلك الدماغية (ضخه الاسكيمية أو احتشاء عضلة القلب) وغير الدماغية (ارتفاع ضغط الدم أو التهاب العضلة القلبية)، تشجيع تعيين الخلايا الملتهبة مع الترميمي والحماية، لكن أيضا الخصائص المسببة للأمراض. أقرب 1891، رومبيرغ أول وصف وجود تتسرب الخلوية في عضلة القلب للمرضى المصابين ب التيفوس والحمى القرمزية1. بيد أن الدراسة التفصيلية للخلايا المناعية القلب يتطلب تطوير تقنيات أكثر تطورا إيمونوفينوتيبينج. نتيجة لذلك، إلا في الآونة الأخيرة قد بدأنا على فهم أن عدد سكان متنوعة من الخلايا المناعية مع أدوار الصيانة الضرورية أثناء حالة ثابتة يتواجد داخل عضلة القلب.
وقد علم الأنسجة، ولا يزال، الأسلوب الأكثر شيوعاً لتوصيف الخلايا المناعية القلب أثناء التهاب. ومع ذلك، حين علم الأنسجة يمثل أداة قيمة لتشخيص، استخدامه في دراسة الخلايا المناعية القلب قد القيود الهامة. تمثل نسبة ضئيلة جداً من مجموع الخلايا الخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب وهي أكثر أو أقل موزعة في مساحة كبيرة نسبيا. وبالمثل، تظهر عدة أشكال من التهاب القلب، مثل فيروسي التهاب العضلة القلبية، أنماط التنسيق من التهاب. وهذا يعني أن التحليل الدقيق للنظام المناعي للقلب غالباً ما تتطلب درجة أعلى من أخذ عينات نسيجية، زيادة التكلفة للحد من التحيز. وعلاوة على ذلك، يوفر علم الأنسجة كمية محدودة جداً من المعلومات يمكن استخدامها في تحديد الخلية (مثل عدد المعلمات). مع عدد متزايد من أي وقت مضى من مجموعات فرعية الخلية التي تتطلب استخدام عدة علامات التعبير (بما في ذلك علامات السطحية أو عوامل النسخ أو جزيئات يفرزها)، التدفق الخلوي أثبتت أنها أقوى أداة إيمونوفينوتيبينج، سبب منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية.
باستخدام تقنيات إيمونوفينوتيبينج يتوقف عن كثب على تطوير كفاءة الهضم البروتوكولات التي تسمح بتحليل خلايا مفردة لإعداد كبيرة من الخلايا. وضع بروتوكولات شاملة لاستخراج خلية فتح نافذة جديدة من الفرص في دراسة علم المناعة القلب. من خلال المزيج من الهضم، والتدفق الخلوي وترانسكريبتوميكس، كان السكان الرئيسية في الضامة، والخلايا الجذعية الذين يقيمون في القلب تتسم2،3. السكان الأكثر وفرة من الخلايا المناعية القلب أثناء حالة ثابتة هي CD64+ميرتك+ الضامة، التي يمكن تقسيمها استناداً إلى التعبير عنها من CCR2 أو CD11c2. CCR2+ الضامة تنبع من هيماتوبويسيس نخاع العظام الكبار، بينما الأغلبية من CCR2 الضامة– ، التي يمكن أن تعبر عن مستويات عالية أو منخفضة من MHC-ثانيا، هم أساسا من أصل قبل الولادة. الضامة المهام الرئيسية مثل إصلاح4 وإزالة الحطام5 أثناء الإصابة أو دعم الربط الكهربائي6 في حالة مستقرة. خلال أشكال مختلفة من التهاب يحدث تدفقا هاما من Ly6Cمرحبا MHC-ثانيالو CD64int وحيدات، التي تفرق في وقت لاحق في Ly6Cمرحبا CCR2+ الضامة2،7 . عدد سكانها الخلايا المقيمين في عضلة القلب الأشخاص الأصحاء أصغر بكثير، ولكن المهم، يتكون من الخلايا الجذعية8،9. واتسمت مؤخرا المجموعات الرئيسية اثنين من وحدات تحكم المجال Dc التقليدية القلب (المؤلفان): cDC1 (CD103+ وحدات تحكم المجال Dc) و cDC2 (CD11b+ وحدات تحكم المجال Dc). وحدات تحكم المجال Dc تلعب أدواراً هامة في الدفاع ضد العدوى8 ولكن يمكن أيضا أن تعزز المتمتعة بالحكم الذاتي-الإصابة أثناء التهاب، لا سيما أثناء احتشاء عضلة القلب9.
وهنا يصف لنا طريقة بسيطة لعزل الخلايا المناعية القلب قابلة للاستمرار من الماوس عضلة القلب. الأسلوب يجمع بين الهضم الأنزيمي والميكانيكية مع خلية-مصفاة ترشيح بغية الحصول على تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها، أو كذلك تنقيته، التدفق الخلوي الفرز أو تخصيب حبة المغناطيسية. تتطلب قياسات دقيقة لخلايا عضلة القلب اكسترافاسكولار القلب نضح من أجل إزالة الملوثات المحتملة من مجرى الدم ميكروفاسكولاتوري القلب. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم خطوة اختيارية لوسم منتثر داخل الأوعية للخلايا المناعية التي يمكن استخدامها لزيادة التفرقة بين خلايا عضلة القلب من الملوثات داخل الأوعية، على أساس بروتوكول et al. البندقية10. وأخيراً، نقدم تحليل تدفق أساسية الخلوي لتحديد الفئات السكانية الفرعية بلعم ومركز السيطرة على الأمراض الرئيسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التهاب عضلة القلب، أو التهاب العضلة القلبية، ميزة لأمراض القلب والأوعية الدموية أكثر. بيد أن عضلة القلب لا يخلو من مكوناته المناعية في الحالات غير المرضية. أثناء حالة ثابتة، العديد من الخلايا المناعية الموجودة في عضلة القلب ولعب أدوار أساسية لصون وحماية. لم يكن وصف هؤلاء السكان متنوعة من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها “المعاهد الكندية للبحوث الصحية” (148808 و 148792)، وأيده سراج الدين القلب ومؤسسة السكتة الدماغية، ومنح الموظفين من مكتب مقاطعة أونتاريو، وآذار/مارس من الدايمات، تيد روجرز مركز بحوث القلب ومونك بيتر مركز القلب. XCC حاصل على “زمالة بانتنغ استوفوا”. لوس أنجليس يحمل القلب والسكتة الدماغية/ريتشارد لور منحة جائزة.
Materials
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
References
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
