Isolatie en identificatie van Extravascular immuuncellen van het hart

Verschillende vormen van myocardiale stress of schade, met inbegrip van ischemische (ischemie-reperfusie of myocardinfarct) en niet-ischemische (hypertensie of myocarditis), bevordering van de rekrutering van ontstekingscellen met herstellend en beschermend, maar ook pathogene eigenschappen. Al in 1891, beschreven Romberg eerst de aanwezigheid van cellulaire infiltreert in het myocardium van patiënten geïnfecteerd met tyfus en roodvonk¹. De gedetailleerde studie van immuun hartcellen vereist echter de ontwikkeling van meer geavanceerde technieken van de immunophenotyping. Dientengevolge, zijn pas onlangs we begonnen te begrijpen dat een diverse bevolking van immune cellen met essentiële onderhoud rollen tijdens steady-state zich binnen het myocardium bevindt.

Histologie is geweest, en nog steeds is, de meest voorkomende methode te karakteriseren immuun hartcellen tijdens ontsteking. Terwijl histologie een waardevolle diagnostisch hulpmiddel vertegenwoordigt, heeft het gebruik ervan in de studie van immuun hartcellen echter belangrijke beperkingen. De immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium vertegenwoordigen een zeer klein percentage van het totaal aantal cellen en zijn min of meer gelijkmatig verdeeld in een proportioneel immense ruimte. Ook Toon verschillende vormen van cardiale ontsteking, zoals virale myocarditis, focal patronen van ontsteking. Dit betekent dat de nauwkeurige analyse van het immuunsysteem van het hart vaak hogere graden van de histologische bemonstering, verhoging van de kosten te verminderen van bias vereisen. Histologie biedt bovendien een zeer beperkte hoeveelheid bruikbare informatie in cel identificatie (bijvoorbeeld aantal parameters). Met een steeds groeiend aantal cel subsets kunt weergeven die het gebruik van meerdere expressie markers vereisen (met inbegrip van oppervlakte markeringen, transcriptiefactoren of secreted moleculen), heeft stroom cytometry zich gevestigd als de meest krachtige tool voor immunophenotyping, Als gevolg van lage kosten en hoge gegevensdoorvoer.

Het gebruik van immunophenotyping technieken is sterk afhankelijk van de ontwikkeling van efficiënte spijsvertering protocollen dat is toegestaan voor single-cellen analyse van grote aantallen cellen. De ontwikkeling van uitputtende protocollen van de extractie van de cel opende een nieuw venster van mogelijkheden in de studie van cardiale immunologie. Door de combinatie van de spijsvertering en stroom cytometry transcriptomics zijn de grote bevolking van macrofagen en dendritische cellen die woonachtig zijn in het hart gekarakteriseerd^2,3. De overvloedigste bevolking van immuun hartcellen tijdens steady-state zijn CD64⁺⁺ MerTK macrofagen, die kunnen verder worden onderverdeeld op basis van hun uitdrukking voor CCR2 of CD11c². CCR2⁺ macrofagen zijn afkomstig uit beenmerg volwassen Haematopoiese, overwegende dat de meerderheid van CCR2^– -macrofagen, dat hoge of lage niveaus van MHC-II uitdrukken kunnen, zijn hoofdzakelijk van prenatale oorsprong. Macrofagen belangrijke taken uitvoeren zoals reparatie⁴ en verwijdering van puin⁵ tijdens blessure of ondersteunende elektrische connectiviteit⁶ in stabiele toestand. Tijdens verschillende vormen van ontstekingen een belangrijke toevloed van Ly6C^hi MHC-II^lo CD64^int monocyten optreden, die later differentiëren in Ly6C^Hallo CCR2⁺ macrofagen^2,7 . Een aanzienlijk kleiner, maar belangrijke bevolking van cellen die woonachtig zijn in het myocardium van gezonde individuen is samengesteld uit dendritische cellen^8,9. De twee belangrijke subsets van cardiale conventionele DCs (cDCs) hebben onlangs gekenmerkt: cDC1 (CD103⁺ DCs) en cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs spelen een belangrijke rol in de verdediging tegen infectie⁸ maar kunnen ook bevorderen zelfverwonding tijdens ontsteking, met name tijdens een myocardinfarct⁹.

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het isoleren van levensvatbare immuun hartcellen van muis myocard. De methode combineert enzymatische en mechanische spijsvertering met een cel-zeef filtratie met het oog op een interne celsuspensie dat kan worden geanalyseerd, of verder gezuiverd is, wat door de stroom cytometry sorteren of magnetische kraal verrijking. Nauwkeurige metingen van extravascular myocardcellen vereisen cardiale perfusie om het verwijderen van eventuele verontreinigingen uit de bloedbaan van de cardiale microvasculature. Daarnaast presenteren wij een optionele stap van intravasculaire labeling van immune cellen die kunnen worden gebruikt om te onderscheiden verder myocardcellen van intravasculaire contaminanten, gebaseerd op de Galkina et al. protocol¹⁰. Tot slot presenteren we een fundamentele stroom cytometry analyse ter identificatie van de grote macrophage en cDC subpopulaties.