Isolamento e identificazione di cellule immunitarie extravascolare del cuore

Diverse forme di stress del miocardio o danno, inclusi ischemico (ischemia riperfusione o infarto del miocardio) e non-ischemica (ipertensione o miocardite), promuovere il reclutamento di cellule infiammatorie con riparatore e protettivo, ma anche Proprietà patogene. Già nel 1891, Romberg descritto in primo luogo la presenza di infiltrati cellulari nel miocardio dei pazienti infettati con il tifo e la scarlattina¹. Tuttavia, lo studio dettagliato delle cellule immuni cardiache richiesto lo sviluppo di tecniche più avanzate di immunofenotipizzazione. Di conseguenza, solo recentemente abbiamo iniziato a capire che una popolazione eterogenea di cellule del sistema immunitario con ruoli di manutenzione essenziali durante stato stazionario risiede all’interno del miocardio.

L’istologia è stato ed è tuttora, il metodo più comune per caratterizzare le cellule immuni cardiache durante l’infiammazione. Tuttavia, mentre l’istologia rappresenta un prezioso strumento diagnostico, suo utilizzo nello studio delle cellule immuni cardiache ha limitazioni importanti. Le cellule immunitarie che risiedono nel miocardio rappresentano una percentuale molto piccola delle cellule totali e sono più o meno uniformemente distribuite in uno spazio immenso proporzionalmente. Allo stesso modo, diverse forme di infiammazione cardiaca, quali miocardite virale, mostrano modelli focali di infiammazione. Questo significa che l’analisi accurata del sistema immunitario del cuore richiedono spesso più alti gradi di campionamento istologico, l’aumento del costo per ridurre i pregiudizi. Inoltre, l’istologia fornisce una quantità molto limitata di informazioni utilizzabili nell’identificazione delle cellule (ad es. numero di parametri). Con un numero sempre crescente di sottoinsiemi di cellule che richiedono l’utilizzo di più indicatori di espressione (compresi gli indicatori di superficie, fattori di trascrizione o molecole secrete), citometria a flusso si è affermata come il più potente strumento per immunophenotyping, a causa di alto-rendimento e basso costo.

L’uso di tecniche di immunophenotyping dipende strettamente lo sviluppo di protocolli di digestione efficiente che ha permesso per l’analisi di singole cellule di un gran numero di cellule. Lo sviluppo di protocolli esaustivi di estrazione delle cellule ha aperto una nuova finestra di opportunità nello studio della immunologia cardiaco. Attraverso la combinazione di digestione, citometria a flusso e trascrittomica, le principali popolazioni di macrofagi e cellule dendritiche che risiedono nel cuore sono stati caratterizzati^2,3. La popolazione più abbondante di cellule immuni cardiache durante allo stato stazionario sono CD64⁺⁺ MerTK macrofagi, che possono essere ulteriormente suddivisi sulla base di loro espressione di CCR2 o CD11c². CCR2⁺ macrofagi hanno origine dal midollo osseo adulto ematopoiesi, considerando che la maggior parte di CCR2 macrofagi^– , che possono esprimere livelli elevati o bassi di MHC-II, sono principalmente di origine prenatale. I macrofagi hanno funzioni chiave come riparazione⁴ e la rimozione di detriti⁵ durante la ferita o sostenere connettività elettrica⁶ in regime stazionario. Durante diverse forme di infiammazione si verificano un importante afflusso di Ly6C^Ciao MHC-II^lo CD64^int monociti, che più successivamente differenziarsi in Ly6C^Ciao CCR2⁺ macrofagi^2,7 . Una popolazione significativamente più piccola, ma importante, di cellule che risiedono nel miocardio di individui in buona salute è composto di cellule dendritiche^8,9. I due sottoinsiemi principali di cardiaca convenzionale DCs (cDCs) sono stati recentemente caratterizzati: cDC1 (CD103⁺ DCs) e cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs svolgono un ruolo importante nella difesa contro l’infezione⁸ , ma può anche promuovere la auto-ferita durante l’infiammazione, in particolare durante l’infarto miocardico⁹.

Qui, descriviamo un metodo semplice per l’isolamento di cellule immuni cardiache vitali dal miocardio del mouse. Il metodo combina digestione enzimatica e meccanica con una filtrazione di cella-setaccio per ottenere una sospensione di singola cellula che può essere analizzata, o ulteriormente purificata, tramite flusso cytometry ordinamento o arricchimento di biglie magnetiche. Misurazioni accurate delle cellule del miocardio extravascular richiedono aspersione cardiaca al fine di rimuovere eventuali contaminanti dal flusso sanguigno del microvasculature cardiaco. Inoltre, vi presentiamo un passaggio facoltativo di etichettatura intravascolare delle cellule immuni che possono essere utilizzate per differenziare ulteriormente le cellule del miocardio da contaminanti intravascolare, basati sul Galkina et al protocollo¹⁰. Infine, presentiamo un’analisi di citometria a flusso di base per identificare le principali sottopopolazioni macrofago e cDC.