Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

1. arıtma için hazırlık Boş hücre ham hazırlanması ayıklamak Bu bir 50 mL konik tüp polyhistidine öğesini metalloprotein25 overexpressed E. coli (BL21) ~ 9-10 g hücre Pelet edinin. Toplam hacim ~ 45-50 mL için hücre Pelet ~ 9-10 g oda geçici lizis/bağlama arabellek (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8) gram başına 5 mL ekleyin. Düzenli olarak dağılması teşvik etmek için girdap. Pelet donmuştu, ılık su banyosu içinde çözülme. Buz-su banyosu kullanarak, hücre süspansiyon ~ 3 ° c hücre lizis için hazırlık soğuk.Not: Bu noktada, hücre lizis sonication, boncuk freze veya başka bir yöntemi mümkündür. Çünkü bu nispeten ucuz, hızlı ve does değil istemek kulak koruma boncuk freze burada gösterilmiştir. Odası üreticinin talimatlarına göre freze 50 mL boncuk bir araya getirin. Dolgu yarım, tam Boncuk Değirmen Odası-20 ° C’de depolanan 0.1 mm cam boncuk soğutulmuş Odası kalan soğutulmuş hücre süspansiyon ile doldurun ve 4 ° C lizis/bağlama arabellek odası tamamen doldurmak için kullanın. Şaft boncuk değirmen döndürmek ve hücre süspansiyon boncuk ile karıştırmak için küçük bir spatula kullanın. Herhangi bir büyük kabarcıkları ile bir damlalıklı kaldırın ve sonra kapağı üstüne vidala. Herhangi bir sızıntı odasından kapalı kuru. Buz yaklaşık 1 fincan için açık, Plastik ceket ekleyin, dolu 50 mL odası dolu buz ceket ve vida kapalı içine ters çevir. Motor üzerine buz ceketli odası güvenli. Boncuk Değirmen 15 saniye 15,800 devirde motor üzerinde açmak, sonra 45 saniye boyunca dinlenmek için izin. 8 kere tekrar edin. 8 döngüsü tamamlandığında, tüm hücre lizis süspansiyon 50 mL veya daha büyük tüp (25.000 g x veya daha yüksek) yüksek hızlı Santrifüjü için dekor içine dikkatle boşaltmak. 4 ° C hücre artıkları ve cam boncuklar cips 40-45 dakika santrifüj ve 25.000 x g spin dengeli tüpler bir çift koyun.Not: mevcut değildir 50 mL veya daha büyük tüpler için yüksek hızlı Santrifüjü dekor, cam boncuk, centrifuging tarafından kaldırın 1000-2000 g 2-3 dk bir 50 mL konik tüp daha küçük bir güç çıkarmak hücre süspansiyon (~ 25 mL) daha küçük bir hacim verim için x e tüp için yüksek hızlı Santrifüjü dekor. Santrifüjü tamamlandığında, berrak, sarı, boş hücre, ham özleri temiz 50 mL konik tüp içine dikkatle boşaltmak. Herhangi bir hücre artıkları aktarmak için dikkat ediniz. Boş hücre ham özleri arıtma daha sonraki analizler için küçük bir örnek toplamak SDS-sayfa26tarafından. IMAC sütun hazırlanması Reçine parçacıklar, radarı kilit çıkışı ve ayrıca uygun bir radarı kilit içeren bir üst kap korumak için daha düşük bir yatak desteği ile donatılmış bir 1.5 x 20 cm sütun edinin. Radarı-kilit çıkış akışını kontrol etmek için bir stopcock ile uygun. Benchtop çalışma, güvenli bir şekilde sütun bir yüzük stand üzerine monte. Nikel-bağlı nitriloacetic asit (Ni-NTA) reçine 4 ° C’de depolanan % 20 etanol içinde % 50 Bulamaç elde Yavaşça eşit reçine yeniden askıya için şişe girdap. Oda sıcaklığında ve benchtop, reçine polyhistidine 50-60 mg bağlama yeteneğine sahip protein öğesini ve bulamaç sütuna aktarmak 2 mL 1 mL verecektir Bulamaç çekilmeye mezun bir damlalıklı yerleşmiş kullanımı üzerinde çalışıyor. Stopcock açın ve reçine düşük yerçekimi tarafından boşaltmak aşırı depolama çözümü sağlar. Stopcock güvenli șekilde kapatır Pasteur damlalıklı kullanarak dikkatli bir şekilde soğutulmuş lizis/bağlama arabellek (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8) ekleyin ve reçine-en az 30 mL sütunun. Reçine yüzey bozmamaya özen. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın. Reçine yavaş yavaş toplama kabı içine yerçekimi tarafından sütundan boşaltmak lizis/bağlama arabellek izin vererek equilibrate. Lizis/bağlama arabellek çoğunlukla drene zaman ~ 5 mL lizis arabelleği reçine kaldığında arabellek akışını durdurmak için stopcock kapatın ve dik, devam etmek için hazır kadar veya en fazla 1 hafta monte sütun bırakın. 2. Polyhistidine öğesini hedef tarafından IMAC saflaştırılması Yıkama tampon (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole pH 8) ve elüsyon tampon (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, % 10 gliserol pH 8) hazırlayın. 4 ° C’de soğuk Ni-NTA sütun boş hücre ham özleri eklenmesi için stopcock açarak ve Ni-NTA reçine ile yerçekimi tarafından boşaltmak için lizis/bağlama arabellek kalan izin hazır olun. Tüm arabellek süzülmüş ve reçine yüzey maruz stopcock kapatın. Bir Pasteur damlalıklı, dikkatle damlalıklı kullanarak hücre ücretsiz ham reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici, ayıklar. Ham özleri duvarları sıçramasına önlemek için sütun aşağı çalıştırın. Ham özleri uygulanan hacmi ifade polyhistidine öğesini protein düzeyine bağlıdır; ham özleri hacmi 50-60 mg içerir emin olmak veya hedef protein mL Ni-NTA reçine başına daha az (bkz. Adım 1.2.4). Tüm ham özleri sütuna devredilmiştir sütun yerçekimi tarafından drenaj olabilir bu yüzden stopcock açın. Bu akış için reçine-SDS-sayfa tarafından arınma daha sonraki analizler için toplamak 100 μL bağlanamadı proteinler oluşur. 26 Boş hücre ham özleri viskozite yerçekimi akışı sütun önemli ölçüde yavaşlatabilir. Akış oranını artırmak için basit bir “el-pompa” uygulanır: Bir 10 mL radarı-kilit şırınga al ve kap plastik boru ve sütun kap ve şırınga radarı-kilit bağlantı parçaları arasında kısa uzunluğu kullanarak sütun bağlayın. Şırınga pistonu çizin ve sonra sıkı bir şekilde uygun sütun üst sütun kap. Yavaşça şırınga pistonu el ile mezun silindir içine eluent toplayarak akış hızı değerlendirilmesi sırasında sıkıştırmak; 1-2 mL / dakika oranları reçine ve bu kurulum ile uyumludur. Akış hızı yavaşlar gibi yavaşça şırınga pistonu sıkıştırma artırın. Hava giriş reçine içine engellemek için sütun başlığını çıkarın ve menisküs uygulanan sıvı reçine yatağın üzerinde 5-10 mm ulaştığında el pompası bağlı ve yerçekimi tarafından boşaltmak zorunda kalan cilt izin. Hücre ücretsiz ham özleri boşaltma tamamladıktan ve reçine yüzey tekrar maruz Pasteur damlalıklı dikkatle ~ 30 mL soğuk yıkama arabellek sütuna reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici – eklemek için kullanın. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın. Stopcock açmak ve yıkama arabellek sütun ile drenaj izin vermek. Bu işlem zayıf ilişkili proteinler reçine kaldırıyor. Eluent atın. Yıkama arabellek boşaltma iken, on altı yaşında hazırlamak etiketli, 1 mL kesirleri toplamak için microcentrifuge tüpler. Yıkama arabellek süzülmüş ve reçine yüzey tekrar maruz stopcock kapatın. Pasteur damlalıklı dikkatle ~ 30 mL soğuk elüsyon arabelleği reçine yüzey bozmamaya dikkat çekici sütun için – eklemek için kullanın. Arabellek sütun sıçramasına önlemek için duvarları aşağı çalıştırın. Stopcock yavaş yavaş açmak ve elüsyon arabellek sütun öğesini polyhistidine protein elute izin vermek. 1 mL eluent her işaretli microcentrifuge tüpler, 1-16 arası toplamak. Renkölçer protein tahlil Bradford tahlil veya belirli yöntemlerine göre UV-görünür spektroskopisi gibi reaktif ve/veya araç üreticileri27,28tarafından kullanarak protein için kesirler test. Burada gösterildiği gibi Coomassie mavi kullanarak Renkölçer tahlil 100 μL birime her fraksiyonu sadece küçük bir birimden kurban için küçültülür. Her kesir Mix 3 μL 100 µL kolorimetrik bir protein ile reaktif tahlil ve el ile protein fraksiyonu varlığını göstermek için herhangi bir renk oluşumu gözlemlemek; algılama bir Spektrometre ile gerekli değildir. Protein fraksiyonu 16 bulunursa, eluted kesirler artık önemli miktarda protein içeren kadar 1 mL kesirler ve tahlil protein için düzenli olarak eluting devam edin. Protein içeren kesirleri temiz konik tüp içine birleştirmek ve daha sonraki analizler için 100 μL örnek SDS-sayfa26tarafından tutar. Metal iyon kofaktör sulandırma ile devam etmek ya da protein 3 mL aliquots-80 ° C’de dondurmak O % 10 gliserol dahil olduğundan emin olun elüsyon arabellek saf protein donma sırasında dengelemek için bir cryoprotectant olduğunu. Ni-NTA sütunun elüsyon tamamlandığında, tüm protein sütundur ve kesirler toplanan, elüsyon arabelleği sütun aracılığıyla başka bir 25 mL geçmek ve sütun 4 ° c ~ 5 mL elüsyon arabelleği için kısa süreli depolama depolamak , veya daha uzun vadeli depolama için % 20 etanol ile lizis/bağlama arabellek. 3. hedef Protein ile Fe2 + sulandırma Fe2 + ekNot: Bu örnekte L-DOPA dioxygenase gibi enzim bağlama heme olmayan demir (II) etkinliği için bir Fe2 + iyon gerektirir; Ancak, demir (II) etkin olan demir (III), kolayca oksitlenir ve protein bir kısmını herhangi bir demir hiç arındırır. Metal sulandırma başlamak için 3 mL saf enzim elüsyon arabellekte askıya alın. Dondurulmuş, hızla ılık su banyosu kullanarak çözme ve bir kez çözdürülen, protein buza koy. Protein hacmi tüp kullanarak, sodyum askorbat (198.1 g/mol) son konsantrasyonu 12,5 mM örnek yapmak için gerekli miktarı hesaplamak. De, dithiothreitol (DTT, 154.25 g/mol) son konsantrasyonu 12,5 mM örnek olması için gereken miktarını hesaplar. Katı sodyum askorbat ve DTT ve tamamen erimesi için yumuşak, ama iyice karıştırın. Protein yağış aşırı saldırgan karıştırma ile neden olmaması için dikkat ediniz. Demir (II) sülfat heptahydrate (MW 278.01 g/mol) az miktarda protein örnek ekleyin. Demir tuz, dokunun yeterince küçük bir miktar birkaç 1 elde etmek için mm granül FeSO4•7H2O dışarı sağlam bir parça kağıt tartmak, granül üzerinde kağıt katlama ve metal bir spatula düz tarafıyla ezersin. Bir tanesini elde edilen toz protein tüp için ekleyin. Girdap karışımı ve pembe pembe renk tüp içinde görünür. Pembe çözüm protein, şapkalı, 10-30 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Pembe renk yavaş yavaş zaman içinde kaybolacak. Jel filtrasyon Küresel polyacrylamide jel 10 mL bir molekül ağırlığı dışlama sınırı yaklaşık 6000 ve 90-180 µm de bir 10 mL rezervuar ile donatılmış bir 1.5 x 12 cm sütundaki sulu parçacık boyutu aralığı dolu bir jel filtrasyon sütun kullanın. Sütun alt ile donatılmıştır ve reçine sütun korumak ve reçine yatak kuru çalışmasını engellemek için 30 um gözenekli polietilen disk şeklinde üst yatak desteklediğinden olun. Jel filtrasyon sütun bir yüzük stand mount. Önceden paketlenmiş jel filtrasyon sütun kullanılıyorsa, kapağını çıkarın ve aşırı arabellek üst yatak destek yukarıda kapalı dökün. Sütun equilibrate için arabellek sonraki tahlil ve Muhafazası, örneğin, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, % 10 gliserol pH 8.0 uyumlu ile havzanın doldurarak başlayın. Önceden paketlenmiş jel filtrasyon sütun kullanılıyorsa, arabellek akışını başlatmak ve radarı kayma uygun maruz jel filtrasyon sütun alt ucu çekin. Bir stopcock sonuna radarı kayma sütun uygun ama açık bırakın ve yerçekimi tarafından damla sütun izin. Arabellek sütun süzülmüş ve üst yatak destek maruz stopcock kapatın ve çözüm maruz üst yatak desteği üzerine pipetting Fe (II) yeniden metalloenzyme ~ 3 mL sütuna ekleyin. Stopcock açmak ve tüm 3,0 mL örnek sütun yerçekimi tarafından girmek izin vermek. Eluent bu ilk 3 mL atmak. Çözüm taşıma sırasında formları herhangi bir pembe renk sütunun üst kısmına sıkışmış. Sütun damlama durdurdu ve üst yatak destek maruz, 4 mL jel-filtrasyon arabelleği (Örneğin, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, % 10 gliserol pH 8.0) için sütun ekleyin. Stopcock açın ve eluent microcentrifuge tüpler içine sekiz 0.5 mL kesirleri toplamak. Renkölçer protein tahlil veya UV-VIS27,28 daha önce açıklandığı gibi kullanarak protein için kesirler test. Protein içeren kesirleri birleştirin. Bir örnek SDS-sayfa analizi26için geri alıyorum. Tahlil veya bir örnek ile devam edin.