Benchtop immobilizzati di cromatografia di affinità del metallo, la ricostituzione e l'analisi di un Polyhistidine contrassegnati metalloenzimi per il laboratorio dello studente non laureato

1. preparazione per la depurazione Preparazione dell’estratto senza cellula grezzo Ottenere un pellet di cellulare ~ 9-10 g di e. coli (BL21) che overexpressed la polyhistidine etichettate metalloproteina25 in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere 5 mL per grammo di buffer di lisi temp/bind camera (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazolo 10 mM a pH 8) il ~ 9-10 g di pellet cellulare per un volume totale di ~ 45-50 mL. Periodicamente il vortice per favorire la dissoluzione. Se il pellet è stato congelato, scongelare in un bagno di acqua tiepida. Usando il bagno di acqua ghiacciata, chill la sospensione cellulare a ~ 3 ° C in preparazione per lisi cellulare.Nota: A questo punto, la lisi delle cellule mediante sonicazione, fresatura perlina o un altro metodo sono possibile. Fresatura della perla è dimostrato qui perché è rapido, relativamente poco costoso e non necessita di una protezione acustica. Assemblare una perlina di 50ml fresatura camera secondo le istruzioni del produttore. Pimento della camera del mulino di perlina mezzo pieno di refrigerati 0,1 mm perline di vetro che sono stati conservati a-20 ° C. Riempire il resto della camera con la sospensione di cella refrigerata e utilizzare buffer di lisi/bind di 4 ° C per riempire completamente la camera. Utilizzare una piccola spatola per ruotare l’albero del mulino perlina e mescolare la sospensione cellulare con le perline. Rimuovere qualsiasi grandi bolle con una pipetta e poi avvitare il coperchio. Asciugare la camera da eventuali perdite. Aggiungere circa 1 tazza di ghiaccio alla giacca chiara, plastica, invertire la camera riempita 50 mL in pieno di ghiaccio giacca e stringi la vite. Fissare la guaina di ghiaccio camera sul motore. Girare il mulino perlina motore su per 15 secondi a 15.800 giri, poi lasciar per riposare per 45 secondi. Ripetere 8 volte. Quando l’8 cicli sono completi, decantare la sospensione di lisi delle cellule intere in un 50 mL o tubo di diametro maggiore nominale per centrifugazione ad alta velocità (25.000 x g o superiore). Inserire una coppia di tubi equilibrati nella centrifuga e spin a 25.000 x g per 40-45 minuti a 4° C a pellet cellulare detriti e perline in vetro.Nota: Se non sono disponibili 50 mL o più grandi tubi voto per centrifugazione ad alta velocità, rimuovere i branelli di vetro mediante centrifugazione a 1000-2000 x g per 2-3 min in una provetta conica 50 mL per produrre un più piccolo volume di sospensione cellulare (~ 25 mL) che può essere travasato in un più piccolo volum tubo e valutato per centrifugazione ad alta velocità. Al termine della centrifugazione, decantare il chiaro, giallo, senza cellula, gli estratti del grezzo in una provetta conica pulito 50 mL. Fare attenzione a non per trasferire eventuali detriti cellulari. Raccogliere un piccolo campione degli estratti senza cellula grezzi per un’analisi successiva della purificazione da SDS-PAGE26. Preparazione della colonna IMAC Ottenere una colonna di 1,5 x 20 cm dotato di un supporto inferiore del letto a trattenere particelle di resina, un’uscita Luer lock e un tappo superiore che contiene anche un raccordo Luer lock. Entra nella presa di attacco Luer-lock con un rubinetto per controllare il flusso. Lavora presso il benchtop, fissare la colonna su un basamento di anello. Ottenere un impasto di 50% di nichel-associazione nitriloacetic acido resina (Ni-NTA) in etanolo al 20% che sia stata conservata a 4 ° C. Agitare delicatamente il flacone per risospendere uniformemente la resina. Lavorando a temperatura ambiente e sul banco, uso depositato una pipetta graduata per aspirare 2 mL del liquame, che produrrà 1 mL di resina in grado di legare il 50-60 mg di polyhistidine etichettato proteine e trasferire i residui nella colonna. Aprire il rubinetto e lasciare che la soluzione di stoccaggio in eccesso di scarico per gravità dalla resina. Chiudere il rubinetto in modo sicuro Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere con cautela il buffer di lisi refrigerati/bind (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazolo 10 mM a pH 8) e alla colonna di resina – almeno 30 mL. Fare attenzione a non per disturbare la superficie della resina. Eseguire il buffer giù le pareti della colonna per evitare schizzi. Equilibrare la resina consentendo il buffer di lisi/bind lentamente dalla colonna di scarico per gravità in un becher di raccolta. Quando il buffer di lisi/bind per la maggior parte ha drenato, chiudere il rubinetto per fermare il flusso del buffer quando ~ 5 mL di tampone di lisi rimane sopra la resina e lasciare la colonna, montata in posizione eretta, fino al momento di procedere o per fino a 1 settimana. 2. purificazione di Polyhistidine-etichetta Target di IMAC Preparare il tampone di lavaggio (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo pH 8) e tampone di eluizione (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazolo 250 mM, pH 10% glicerolo 8). Raffreddare a 4° C. Preparare la colonna Ni-NTA per l’aggiunta degli estratti senza cellula greggi aprendo il rubinetto e consentendo restanti buffer di lisi/associazione di scarico per gravità attraverso la resina Ni-NTA. Quando tutto il buffer è vuoto, e la superficie della resina è esposto, chiudere il rubinetto. Utilizzando una pipetta Pasteur, attentamente dispensare il greggio gratis cellulare estrae sulla resina, facendo attenzione a non per disturbare la superficie. Eseguire gli estratti grezzi lungo le pareti della colonna per evitare schizzi. Il volume degli estratti grezzi applicato è dipenda dal livello di espressione della proteina polyhistidine-etichetta; garantire il volume totale degli estratti grezzi contiene 50-60 mg o meno della proteina per mL di resina Ni-NTA (Vedi punto 1.2.4). Quando tutti gli estratti grezzi sono stati trasferiti alla colonna, è necessario aprire il rubinetto così la colonna può scarico per gravità. Questo flusso attraverso è composto di proteine che non ha fatto associare alla resina – raccogliere 100 μL per un’analisi successiva della purificazione mediante SDS-PAGE. 26 La viscosità degli estratti senza cellula grezzi può rallentare notevolmente il flusso di gravità della colonna. Per aumentare la velocità del flusso, applicare un semplice “pompa a mano”: Prendere una siringa 10 mL Luer-lock e collegarlo al tappo della colonna utilizzando un breve tratto di tubazione di plastica e raccordi Luer lock tra il tappo di colonna e la siringa. Disegnare lo stantuffo della siringa e quindi fissare strettamente il tappo di colonna nella parte superiore della colonna. Comprimere delicatamente lo stantuffo della siringa mentre manualmente valutare il tasso di flusso attraverso la raccolta di eluente in un cilindro graduato; tariffe di 1-2 mL al minuto sono compatibili con la resina e il programma di installazione. Delicatamente aumentare compressione del pistone della siringa in quanto rallenta la velocità di flusso. Per evitare l’introduzione di aria nella resina, togliere il tappo di colonna e collegato la pompa a mano quando il menisco del liquido applicato raggiunge il 5-10 mm sopra il letto di resina e consentire il volume residuo di scarico per gravità. Quando estratti grezzi libero delle cellule hanno finito drenante e la superficie della resina viene esposto nuovamente, è possibile utilizzare una pipetta Pasteur attentamente aggiungere ~ 30 mL di tampone di lavaggio refrigerato alla colonna – facendo attenzione a non per disturbare la superficie della resina. Eseguire il buffer giù le pareti della colonna per evitare schizzi. Aprire il rubinetto e permettere al tampone di lavaggio di defluire attraverso la colonna. Questo processo è rimozione proteine debolmente limitati dalla resina. Scartare l’eluente. Mentre il tampone di lavaggio è drenante, sedici anni, preparare provette microcentrifuga per la raccolta di frazioni di 1 mL. Quando il tampone di lavaggio è vuoto, e la superficie della resina viene esposto nuovamente, chiudere il rubinetto. Utilizzare una pipetta di Pasteur attentamente aggiungere ~ 30 mL di tampone di eluizione refrigerate alla colonna – facendo attenzione a non per disturbare la superficie della resina. Eseguire il buffer giù le pareti della colonna per evitare schizzi. Aprire lentamente il rubinetto e permettere al tampone di eluizione eluire la proteina di polyhistidine contrassegnati dalla colonna. Raccogliere 1 mL di eluente in ciascuna delle provette microcentrifuga contrassegnato, da 1 a 16. Testare le frazioni per proteina usando un’analisi colorimetrica della proteina come l’analisi di Bradford o spettroscopia UV-visibile secondo i metodi specifici di reagente e/o strumento Produttore27,28. Come illustrato di seguito, il saggio colorimetrico utilizzando blu di Coomassie è ridotta a un volume di 100 μL per sacrificare solo un piccolo volume da ogni frazione. Mix 3 μL di ogni frazione con 100 µ l di una proteina colorimetrica dosaggio reagenti e manualmente osservare la formazione di qualsiasi colore per indicare la presenza di proteina nella frazione; rilevamento con uno spettrometro non è necessario. Se proteina si trova in frazione 16, continuare a eluizione di frazioni di 1 mL e analisi per la proteina periodicamente, fino a quando le frazioni eluite non contengono una notevole quantità di proteine. Combinare le frazioni contenenti proteine in una provetta pulita e prelevare un campione di 100 μL per un’analisi successiva da SDS-PAGE26. Procedere con la ricostituzione del cofattore ione metallico o congelare la proteina in aliquote di mL 3 a-80 ° C. Assicurare quel 10% glicerolo è incluso nell’eluizione buffer è un crioprotettore per stabilizzare la proteina pura durante il congelamento. Quando eluizione della colonna Ni-NTA è completa, vale a dire tutte le proteine sono spento la colonna e raccolti in frazioni, passare un altro 25 mL di tampone di eluizione attraverso la colonna e memorizzare la colonna a 4 ° C in ~ 5 mL di tampone di eluizione per la conservazione a breve termine , o buffer di lisi/bind con etanolo al 20% per l’archiviazione a lungo termine. 3. la ricostituzione della proteina bersaglio con Fe2 + Aggiunta di Fe2 +Nota: Un ferro non-eme (II) associazione degli enzimi, come la l-dopa diossigenasi in questo esempio, richiede un ione Fe2 + per attività; Tuttavia, il ferro (II) si ossida facilmente a ferro (III), che è inattivo, e una frazione della proteina purifica senza qualsiasi ferro a tutti. Per iniziare la ricostituzione del metallo, ottenere 3 mL dell’enzima purificato sospesa in tampone di eluizione. Se congelato, scongelare rapidamente usando un bagno di acqua tiepida e una volta scongelati, mettere la proteina sul ghiaccio. Utilizzando il volume della proteina nel tubo, calcolare la quantità di ascorbato di sodio (198.1 g/mol) necessaria per rendere la concentrazione finale 12,5 mM nel campione. Inoltre, calcolare la quantità di ditiotreitolo (DTT, 154.25 g/mol) necessaria per rendere la concentrazione finale 12,5 mM nel campione. Aggiungere l’ascorbato di sodio solido e DTT e delicatamente, ma a fondo, mescolare per sciogliere completamente. Fare attenzione a non per causare precipitazione della proteina con miscelazione eccessivamente aggressivo. Aggiungere una piccola quantità di ferro (II) solfato eptaidrato (MW 278.01 g/mol) per il campione della proteina. Al fine di ottenere una quantità abbastanza piccola del rubinetto salata, Ferro 1 pochi millimetri granuli di FeSO4•7H2O solido fuori su un pezzo di pesano la carta, piegare la carta sopra il granulo e schiacciano con la parte piatta di una spatola di metallo. Aggiungere un granello di polvere risultante al tubo della proteina. Vortice di mescolare e un colore rosa rosato apparirà nel tubo. Incubare la soluzione rosa della proteina, il limite massimo, per 10-30 minuti sul ghiaccio. Il colore rosa si sbiadirà lentamente nel tempo. Gel filtrazione Utilizzare una colonna di gel filtrazione imballata con 10 mL di gel di poliacrilammide sferico con un limite di esclusione del peso molecolare di circa 6.000 e una gamma di dimensione di particella idratata di 90 – 180 µm in una colonna di 1.5 x 12 cm, che è anche dotata di un serbatoio da 10 mL. Garantire la colonna è dotata di inferiore e letto superiore supporta sottoforma di 30 dischi di Umm in polietilene per mantenere la resina nella colonna e prevenire il letto di resina dal funzionamento a secco. Montare la colonna di gel filtrazione per uno stand di anello. Se si utilizza una colonna di filtrazione gel pre-confezionati, rimuovere il tappo e versare il tampone in eccesso sopra il supporto del letto superiore. Per equilibrare la colonna, iniziare a riempire il serbatoio con tampone compatibile con successiva analisi e archiviazione, ad esempio, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glicerolo pH 8.0. Se si utilizza una colonna di filtrazione gel pre-confezionati, scattare fuori la punta inferiore della colonna di gel filtrazione per avviare il flusso del buffer ed esporre il raccordo scorrevole Luer. Montare un rubinetto per la fine di slittamento di Luer della colonna, ma lasciarla aperta e consentire la colonna a gocciolare dalla forza di gravità. Quando il buffer è vuoto dalla colonna e il supporto del letto superiore è esposta, chiudere il rubinetto e aggiungere i ~ 3 mL di metalloenzimi il Fe (II) ricostituito nella colonna pipettando la soluzione sul supporto letto superiore esposta. Aprire il rubinetto e lasciare il campione intero 3,0 mL immettere la colonna dalla forza di gravità. Eliminare questi primi 3 mL di eluente. Qualsiasi colore rosa che si forma durante la manipolazione la soluzione sarà intrappolato nella parte superiore della colonna. Quando la colonna ha smesso di gocciolamento e il supporto del letto superiore è esposta, è possibile aggiungere 4 mL di tampone gel-filtrazione (ad es., 50mm NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glicerolo pH 8.0) alla colonna. Aprire il rubinetto e raccogliere l’eluente in microcentrifuga su otto frazioni di 0,5 mL. Testare le frazioni per proteina usando un’analisi colorimetrica della proteina o UV-Vis27,28 , come descritto in precedenza. Combinare le frazioni contenenti proteine. Prelevare un campione per analisi di SDS-PAGE26. Procedere con l’analisi o la conservazione del campione.