ベンチトップ固定金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー、再構成し、Polyhistidine のアッセイ学部の研究室の金属をタグ付き

1. 浄化のための準備 細胞粗抽出物の調製 大腸菌(BL21) 50 mL コニカル チューブで polyhistidine タグ付きの金属タンパク質25を過剰発現の 9 ~ 10 g 細胞ペレットを取得します。 容量は 45 〜 50 mL の細胞ペレットの 9 ~ 10 g ルーム一時換散/バインド バッファー (50 mM リン酸、300 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール ph 8) の 1 グラムあたり 5 mL を追加します。定期的に溶解を促進する渦。ペレットが固定されている場合は、ぬるま湯のお風呂で解凍します。 セル換散のための準備で 〜 3 ° C に細胞懸濁液を冷やす氷水浴室を使用して。注: この時点で、超音波処理、ビード切削または別の方法でセル換散は可能です。それは急速な比較的安価な耳の保護具を必要としないので、ビード切削がここに示されています。 製造元の指示に従ってチャンバーを加工 50 mL ビーズを組み立てます。 塗りつぶしの完全な半分ビーズ ミル室冷蔵-20 ° C で保存されている 0.1 mm ガラスビーズ チルド細胞懸濁液と商工会議所の残りの部分を埋めるし、完全にチャンバーに 4 ° C の溶解/バインド バッファーを使用します。 ビーズ工場のシャフトを回転させ、細胞懸濁液を混ぜて、ビーズに小さなヘラを使用します。 、ピペットを使い、任意の大きな泡を削除し、上ふたをネジします。 チャンバー任意の漏れからを完全に乾かし。 氷いっぱいのジャケットと閉じてネジに 50 mL の充填室を反転、プラスチック ジャケットに氷の約 1 カップを追加します。 モーターにアイス ジャケット室を確保します。 15,800 rpm で 15 秒間ビーズ ミルをモーターで回転し、45 秒間休むことができます。8 回繰り返します。 8 サイクルが完了したら、全体のセル換散のサスペンションをデカント 50 mL に大きいチューブ高速遠心分離 (25,000 g 以上) の評価を受けています。細胞の破片やガラスのビーズをペレットへの 4 ° C で 40-45 分遠心分離機と 25,000 x g でスピンでバランスの取れたチューブのペアを配置します。注: 50 mL と高速遠心分離のための評価より大きい管が利用できない場合削除ガラス ビーズで遠心分離 50 mL の円錐管より小さいべリにデカントすることができますセル中断 (〜 25 mL) の小さいボリュームを生成するために 2 〜 3 分の g x 1000-2000e チューブ高速遠心分離の評価を受けています。 遠心分離が完了したら、携帯無料クリア、イエローをデカント、きれいな 50 mL の円錐管に原油を抽出します。任意の細胞の残骸を転送しないように注意して取る。 SDS ページ26の浄化の後で分析細胞粗抽出物の小さなサンプルを収集します。 IMAC のコラムの準備 樹脂粒子、ルアーロック ロック コンセントとルアー ロック継ぎ手を含む上部のキャップを保持する下のベッド サポート装備 1.5 x 20 cm 列を取得します。流れを制御するバルブのルアーロック コンセントに適合します。 リング スタンドに列をマウントするベンチトップで働いて、しっかりと。 4 ° C で保存されている 20% エタノールでニッケル バインド nitriloacetic 酸 (Ni NTA) 樹脂の 50% のスラリーを取得します。 軽く均等に樹脂を再停止するボトルを旋回します。 作業室温とベンチトップ、卒業ピペット 2 mL の 1 mL をもたらすスラリーを撤回する定住樹脂 polyhistidine の 50-60 mg を結合できる蛋白質のタグし、列にスラリーを転送を使用します。 活栓を開き、樹脂から重力によって流出する余分なストレージ ソリューションを許可します。 安全に、活栓を閉じる パスツール ピペットを使用して慎重に冷やして換散/バインド バッファー (50 mM リン酸、300 mM の NaCl、10 mM のイミダゾール ph 8) を追加して樹脂-少なくとも 30 mL カラム。樹脂表面を邪魔しないように注意してください。飛散防止のための列の壁をバッファーを実行します。 コレクション ビーカーに重力によって列からゆっくり流出する溶解/バインド バッファーを許可することで、樹脂を平衡します。 バインド/換散バッファーに排水している主 ~ 5 mL の溶解バッファーが樹脂の上に残っている場合、バッファーの流れを停止する活栓を閉じ、直立、続行する準備ができるまで、1 週間をマウントされている列のまま。 2. IMAC で Polyhistidine タグ ターゲットの浄化 洗浄バッファー (50 mM リン酸、300 mM の NaCl、20 mM のイミダゾール pH 8) と溶出バッファー (50 mM リン酸、300 mM の NaCl、250 mM のイミダゾール、10% グリセリン pH 8) を準備します。4 ° C でチルします。 原油の無細胞抽出液添加の活栓を開いて、Ni NTA 樹脂を介して重力によって排出する換/結合バッファーの残りを許可する Ni NTA 列を準備します。すべてのバッファーに排水しているし、樹脂表面がさらされて、活栓を閉じる。 携帯無料原油をパスツール ピペットで移しなさい、慎重にピペットを使用して樹脂で表面を邪魔しないように世話に抽出します。飛散防止のための列の壁を粗抽出を実行します。適用される粗野なエキスの量は polyhistidine タグ付きタンパク質の発現のレベルに依存粗抽出物の総量 50-60 mg が含まれていることを確認または Ni NTA 樹脂の mL あたりターゲット蛋白質の少ない (ステップ 1.2.4 を参照してください)。 粗野なエキスのすべては列に転送されているとき、活栓を開いて列を重力によって排出することができます。この流れは、樹脂-SDS-PAGE による浄化の後の分析のため収集 100 μ L にバインドされないタンパク質で構成されます。26 原油無細胞抽出液の粘度はかなり列の重力流れを遅くできます。流れの速度を上げるには、単純な「ハンドポンプ」を適用します。 10 mL ルアーロック注射器を取るし、プラスチック製のチューブと列キャップと注射器の間ルアーロック継手の短い長さを使用して、列のキャップに接続します。シリンジのプランジャーを引き出すし、列の上部にある列キャップに収まります。 優しく; メスシリンダーに溶離液を集めることによって流量を手動で評価しながら、シリンジのプランジャーを圧縮します。1-2 mL の 1 分あたりの料金は、樹脂とこのセットアップと互換性が。流量が低下、ゆっくりシリンジのプランジャーの圧縮を上げます。 樹脂への空気の導入を防ぐためには、列の cap を削除し応用液体のメニスカス樹脂ベッドの上の 5-10 の mm に達すると手押しポンプを接続でき、重力によって排出する残りのボリューム。 携帯無料粗抽出物が排水完了し、樹脂表面は再び公開されている慎重に樹脂表面を邪魔しないように世話コラムに 〜 30 mL の冷製洗浄バッファーを追加するのにパスツール ピペットを使用します。飛散防止のための列の壁をバッファーを実行します。 活栓を開き、列を通って流出する洗浄バッファーを許可します。このプロセスは、樹脂から弱結合蛋白質が削除されます。溶離液を破棄します。 洗浄バッファーを排水すると、準備、16 というラベルの付いた、1 mL の一部分を収集するためのマイクロ遠心チューブ用。 洗浄バッファーに排水しているし、樹脂面が再び露出、活栓を閉じる。慎重に 〜 30 mL のチルドの溶出バッファーを列-樹脂表面を邪魔しないように世話に追加するのにパスツール ピペットを使用します。飛散防止のための列の壁をバッファーを実行します。 活栓をゆっくり開くし、列から polyhistidine タグ付きタンパク質を溶出溶出バッファーを許可します。マーク マイクロ遠心チューブ用、16 までの 1 の各溶離液の 1 mL を収集します。 ブラッドフォードの試金など特定の方法に従って紫外可視分光測色的蛋白質の試金の試薬や機器のメーカー27,28を用いたタンパク質の画分をテストします。下図のように、Coomassie 青いを用いた比色定量法はスケール ダウン 100 μ L のボリュームに各画分から少量だけを犠牲にするために。 比色蛋白質の 100 μ L の各分画のミックス 3 μ L 測定試薬と手動で、端数のタンパク質の存在を示すための任意の色の形成を観察分光計の検出は必要ありません。 16 画分タンパク質が見つかった場合を続行 1 mL の一部分と蛋白質の試金を定期的に、溶出溶出画分タンパク質を多量に含まれなくなります。 きれいな円錐管に蛋白質を含む分数を組み合わせるし、SDS ページ26後分析用 100 μ L のサンプルを撤回します。 金属イオン補足因子の再構成を続行または-80 ° C で 3 mL 因数でタンパク質を凍結その 10% グリセロールが含まれていることを確認、溶出バッファーは凍結中に純粋なタンパク質を安定させるために保護剤の検討。 Ni NTA カラムの溶出が完了したら、つまり、列になってすべての蛋白質と、分数で収集した別 25 mL の溶出バッファーの列、全体の ~ 5 mL の短期記憶の溶出バッファー 4 ° C で列を格納、または長期の保管用 20% エタノールで溶解/バインド バッファー。 3. Fe2 +と標的タンパク質の再構成 Fe2 +の追加注: 非ヘム鉄 (II) この例では L-DOPA ジオキシゲナーゼなどの酵素を結合アクティビティの Fe2 +イオンが必要です。鉄 (II) はすぐにアクティブではない鉄 (III) に酸化し、タンパク質の割合が全然、鉄なし浄化します。 金属の溶解を開始するには、3 mL の溶出バッファーで中断精製酵素を取得します。ぬるま湯のお風呂を使用して迅速に解凍し、一度融解したものに、氷の上のタンパク質を入れて固定されている場合。 チューブの蛋白質の量を使用して、アスコルビン酸ナトリウム (198.1 g/mol) サンプルの最終濃度 12.5 mM を作るに必要な量を計算します。また、ジチオトレイトール (DTT、154.25 g/mol) サンプルの最終濃度 12.5 mM を作るに必要な量を計算します。 固体ナトリウム アスコルビン酸と DTT を追加し、やさしく、しかし徹底的に完全に溶解してミックスします。過度に積極的な混合と蛋白質の沈殿物が発生しないように注意して取る。蛋白質のサンプルに微量鉄 (II) 硫酸塩七水和物 (MW 278.01 g/mol) を追加します。 鉄塩、タップ数が十分に小さい数 1 を得るために mm 顆粒 FeSO4•7H2O を固体の部分の紙の重量を量る、顆粒、上、紙を折るし、金属のヘラの平らな面でそれを粉砕します。 タンパク質のチューブに結果として得られる粉末の粒度を追加します。 ミックスする渦とバラ色のピンク色は、チューブに表示されます。 タンパク質、キャップ、氷の上の 10-30 分のためのピンクのソリューションを孵化させなさい。ピンク色は、ゆっくりと時間をかけてフェードします。 ゲルろ過 約 6,000 の分子量排除限界 10 mL タンクが装備されても 1.5 x 12 cm] 列で 90-180 μ m の水分粒子サイズの範囲と球状ポリアクリルアミドゲルの 10 mL を充填したゲルろ過カラムを使用します。列が下位装備し、上段のベッドを列でガレージを保持し、ドライ運転から樹脂ベッドを防ぐため 30 um 多孔質ポリエチレン ディスクの形でサポートしているを確認します。リング スタンドをゲルろ過カラムをマウントします。 あらかじめパッケージ化されたゲルろ過カラムを使用している場合は、キャップをはずし、上部ベッド サポート上余分なバッファーを注ぐ。 コラムを平衡させ、まずバッファーの後続アッセイおよびストレージ、たとえば、50 ミリメートル NaH2PO4, 200 mM の NaCl、ph 8.0 10% グリセロールとの互換性で貯水池を充填します。 あらかじめパッケージ化されたゲルろ過カラムを使用している場合は、バッファーのフローを開始し、ルアーロック スリップ フィットを公開するゲルろ過カラムの下部の先端をスナップします。列のルアーロック スリップまで活栓を合わせて開いたまま、重力によって点滴する列を許可します。 バッファーが列から排水するいるし、上段のベッド サポート公開されます、活栓を閉じるし、露出上部ベッド サポートに溶液をピペットで列に Fe (II) 再構成スプライシングイントロン 〜 3 mL を追加します。 活栓を開き、重力によって列を入力する全体の 3.0 mL サンプルを許可します。溶離液のこれらの最初の 3 mL を破棄します。ソリューションの処理中を形成する任意のピンク色は、列の先頭に保持されます。 列は、滴下を停止するいるし、上段のベッド サポート公開されます 4 mL のゲル濾過バッファー (例えば、 50 mM NaH2PO4、200 mM の NaCl、ph 8.0 10% グリセロール) を列に追加します。活栓を開き、8 つの 0.5 mL 成分を遠心管に溶離液を収集します。 前述のように測色的蛋白質の試金または紫外-可視27,28を用いたタンパク質画分をテストします。 タンパク質を含む分数を組み合わせます。 SDS-PAGE 解析26のサンプルを撤回します。 アッセイまたはサンプルの保存を続行します。