Benchtop immobilisé par chromatographie d’affinité métallique, Reconstitution et analyse d’un Polyhistidine tag métalloenzyme pour le laboratoire d’études de premier cycle

1. préparation pour la Purification Préparation de l’extrait brut acellulaire Obtenir un culot ~ 9-10 g d’ e. coli (BL21) qui surexprimé la polyhistidine Taggé metalloprotein25 dans un tube conique de 50 mL. Ajouter 5 mL par gramme de tampon de lyse temp/identification de chambre (50 mM Phosphate, 300 mM NaCl, imidazole de 10 mM à pH 8) à environ 9-10 g de culot pour un volume total ~ 45-50 mL. Périodiquement de vortex pour encourager la dissolution. Si la pastille a été gelée, décongeler dans un bain d’eau tiède. En utilisant le bain d’eau glacée, faites refroidir la suspension cellulaire à environ 3 ° C en prévision de la lyse cellulaire.Remarque : À ce stade, la lyse cellulaire par sonication, fraisage de perle ou une autre méthode est possible. Fraisage de la perle est démontré ici parce qu’il est rapide, relativement peu coûteux et n’exige pas des protections auditives. Assembler une bille de 50 mL fraisage chambre selon les instructions du fabricant. Remplir la chambre de moulin de perle moitié plein de réfrigérés 0,1 mm perles en verre qui ont été stockés à-20 ° C. Remplir le reste de la chambre avec la suspension de cellules réfrigérées et tampon de lyse/identification de 4 ° C permet de remplir la chambre complètement. Utilisez une petite spatule pour faire tourner l’arbre de l’usine de perles et de mélanger la suspension cellulaire avec les perles. Éliminez les grandes bulles avec une pipette et puis visser le couvercle. Sec hors de la chambre de toute fuite. Ajouter environ 1 tasse de glace à la veste claire, en plastique, inverser la chambre remplie de 50 mL dans la veste de glace rempli et le visser fermé. Sécuriser la chambre de glace-chemisé sur le moteur. Tourner le moulin de perle moteur sur pendant 15 secondes à 15 800 tr/min, puis laissez pour reposer pendant 45 secondes. Répétez 8 fois. Lorsque les 8 cycles sont complétés, décanter la suspension de la lyse cellulaire tout en 50 mL ou plus grand tube conçu au centrifugation à haute vitesse (25 000 x g ou supérieur). Placer une paire de tubes équilibrés dans la centrifugeuse et un essorage à 25 000 x g pendant 40-45 minutes à 4° C pour granuler des perles de verre et de débris cellulaires.Remarque : Si 50 mL ou plus gros tubes calibrés pour la centrifugation à haute vitesse ne sont pas disponibles, retirer les perles de verre par centrifugation à 1000-2000 x g pendant 2-3 min dans un tube conique de 50 mL pour donner un plus petit volume de suspension cellulaire (~ 25 mL) qui peut être décanté dans un plus petit volum tube e convenant de centrifugation à haute vitesse. Lorsque centrifugation est terminée, décanter le clair, jaune, acellulaire, brut extrait dans un tube conique propre de 50 mL. Prendre soin de ne pas pour transférer les débris cellulaires. Recueillir un petit échantillon des extraits bruts acellulaire pour une analyse ultérieure de la purification par SDS-PAGE26. Préparation de la colonne de l’IMAC Obtenir une colonne de 1,5 x 20 cm équipée d’un support de lit inférieur pour retenir les particules de résine, une prise de verrouillage Luer et un capuchon qui contient également un raccord Luer lock. Correspond à la prise de connecteur Luer-lock avec un robinet d’arrêt pour contrôler le flux. Travaillant à la paillasse, fixer la colonne sur un support de bague. Obtenir une suspension de 50 % de résine de (Ni-NTA) acide nitriloacetic nickel-bondissent dans 20 % d’éthanol qui a été stockée à 4 ° C. Doucement agiter le flacon pour remettre en suspension uniformément la résine. Travailler à température ambiante et applications, utiliser une pipette jaugée de retirer 2 mL de la solution aqueuse, qui produira 1 mL de réglé résine capable de se lier à 50-60 mg de polyhistidine protéine contenant le tag et transférer la suspension dans la colonne. Ouvrir le robinet et laisser la solution de stockage excessif s’écouler par gravité de la résine. Bien fermer le robinet d’arrêt À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter avec précaution le tampon de lyse réfrigérés/bind (50 mM Phosphate, 300 mM NaCl, imidazole de 10 mM à pH 8) et à la colonne de résine – au moins 30 mL. Prendre soin de ne pas pour troubler la surface de la résine. Exécutez le tampon vers le bas les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures. Equilibrer la résine en permettant le tampon de lyse/bind s’écouler lentement de la colonne par gravité dans un bécher de collection. Lorsque le tampon de lyse/bind a principalement été vidangée, fermez le robinet d’arrêt pour arrêter le flux de mémoire tampon lorsque environ 5 mL de tampon de lyse se maintient au-dessus de la résine et laisser la colonne, montée verticalement, jusqu’au moment de procéder ou pour 1 semaine. 2. purification de Polyhistidine-tag cible par IMAC Préparer le tampon de lavage (50 mM 300 mM NaCl, le Phosphate, pH imidazole de 20 mM 8) et de la mémoire tampon d’élution (50 mM Phosphate, NaCl, imidazole de 250 mM, 300 mM 10 % de glycérol, pH 8). Refroidir à 4° C. Préparer la colonne Ni-NTA pour l’ajout d’extraits bruts acellulaire en ouvrant le robinet d’arrêt et permettant restant de tampon de lyse/liaison s’écouler par gravité à travers la résine Ni-NTA. Lorsque toute la mémoire tampon a été vidangée, et affleure la surface de la résine, fermer le robinet. Le brut libre de cellules à l’aide d’une pipette Pasteur, soigneusement la pipette extraits sur la résine, en prenant soin de ne pas pour troubler la surface. Exécuter les extraits bruts sur les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures. Le volume des extraits bruts appliquée dépend du niveau d’expression de la protéine polyhistidine-étiquetée ; s’assurer que le volume total des extraits bruts contient 50 à 60 mg ou moins de la protéine cible par mL de résine Ni-NTA (voir étape 1.2.4). Lorsque tous les extraits bruts ont été transférés à la colonne, ouvrir le robinet afin que la colonne peut vider par gravité. Ce flux à travers est composé de protéines qui ne se lient pas à la résine – collecter 100 μL pour une analyse ultérieure de la purification par SDS-PAGE. 26 La viscosité des extraits bruts acellulaire peut ralentir l’écoulement par gravité de la colonne considérablement. Pour augmenter la vitesse d’écoulement, appliquer un simple « pompes » : Prenez une seringue de 10 mL Luer-lock et connectez-le à l’extrémité de la colonne à l’aide d’un petit morceau de tube en plastique et des raccords Luer-lock entre le plafond de la colonne et la seringue. Tirez le piston de la seringue et le fixer fermement le cap de la colonne sur le dessus de la colonne. Comprimer légèrement le piston de la seringue tout en évaluant manuellement le débit en recueillant l’éluant dans une éprouvette graduée ; taux de 1 à 2 mL / minute sont compatibles avec la résine et cette configuration. Doucement augmenter la compression du piston de la seringue que le débit ralentit. Pour empêcher l’introduction d’air dans la résine, enlever le capuchon de la colonne et joint pompe manuelle lorsque le ménisque du liquide appliqué atteint 5 à 10 mm au-dessus du lit de résine et permettent le volume restant s’écouler par gravité. Quand les extraits bruts libre de cellule ont fini drainant et la surface de la résine est exposée à nouveau, utilisez une pipette Pasteur pour ajouter avec précaution environ 30 mL de tampon de lavage réfrigéré à la colonne – en prenant soin de ne pas pour troubler la surface de la résine. Exécutez le tampon vers le bas les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures. Ouvrir le robinet et laisser le tampon de lavage s’écouler à travers la colonne. Ce processus enlève protéines faiblement liés de la résine. Jeter l’éluant. Tandis que le tampon de lavage est drainante, préparer, seize ans, étiqueté, microtubes à centrifuger pour rassemblant des fractions de 1 mL. Dès que le tampon de lavage a été vidangée, et la surface de la résine est encore exposée, fermer le robinet d’arrêt. Utiliser une pipette Pasteur pour ajouter avec précaution environ 30 mL de tampon d’élution réfrigérés à la colonne – en prenant soin de ne pas pour troubler la surface de la résine. Exécutez le tampon vers le bas les murs de la colonne pour éviter les éclaboussures. Ouvrir le robinet lentement et laisser le tampon d’élution Éluer la protéine polyhistidine avec étiquette de la colonne. Collecter 1 mL de l’éluant dans chacun des tubes de microcentrifuge marqué, 1 à 16. Tester les fractions de protéine par dosage colorimétrique de protéines telles que l’analyse de Bradford ou spectroscopie UV-Visible selon des méthodes spécifiques par le réactif et/ou instrument fabricants27,28. Tel qu’illustré ici, le dosage colorimétrique à l’aide de bleu de Coomassie est réduit à un volume μL 100 pour sacrifier seulement un petit volume de chaque fraction. Mix 3 μL de chaque fraction avec 100 µL d’une protéine colorimétrique réactifs de dosage et manuellement observe la formation de n’importe quelle couleur pour indiquer la présence de protéines dans la fraction ; détection avec un spectromètre n’est pas nécessaire. Si la protéine est présente dans la fraction 16, continuer à élution de fractions de 1 mL et dosage des protéines régulièrement, jusqu’à ce que les fractions éluées ne contenant une quantité importante de protéines. Combiner des fractions protéiques dans un tube conique propre et retirer un échantillon de 100 μL pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE26. Procéder à la reconstitution du cofacteur de l’ion métallique ou geler la protéine en aliquotes de 3 mL à-80 ° C. Veiller à ce que 10 % de glycérol est inclus dans l’élution tampon est un cryoprotecteur pour stabiliser les protéines pures au cours du gel. Lors de l’élution de la colonne de Ni-NTA est terminée, c’est-à-dire toutes les protéines sont au large de la colonne et recueillis dans les fractions, passer un autre 25 mL de tampon d’élution par le biais de la colonne et stocker la colonne à 4 ° C en environ 5 mL de tampon d’élution pour le stockage à court terme , ou le tampon de lyse/bind avec 20 % d’éthanol pour le stockage à long terme. 3. la reconstitution de la protéine cible avec Fe2 + Ajout de Fe2 +Remarque : Un fer non hémique (II) liaison enzyme, par exemple la dioxygénase L-DOPA dans cet exemple, nécessite un ion Fe2 + pour l’activité ; Cependant, le fer (II) s’oxyde facilement en fer (III), qui est inactif, et une fraction de la protéine purifie sans aucun fer à tous. Pour commencer la reconstitution du métal, obtenir 3 mL de l’enzyme purifiée en suspension dans le tampon d’élution. Si gelé, décongeler rapidement à l’aide d’un bain d’eau tiède et une fois décongelé, mettre la protéine sur la glace. En utilisant le volume de protéine dans le tube, calculer le montant d’ascorbate de sodium (198,1 g/mol) nécessaire pour que la concentration finale 12,5 mM dans l’échantillon. En outre, calculer le montant de dithiothréitol (DTT, 154.25 g/mol) nécessaire pour que la concentration finale 12,5 mM dans l’échantillon. Ajouter l’ascorbate de sodium solide et sur la TNT et doucement, mais complètement, mélanger pour dissoudre complètement. Prendre soin de ne pas pour provoquer la précipitation de protéines avec mélange trop agressifs. Ajouter une petite quantité de sulfate de fer (II) heptahydraté (278.01 MW g/mol) à l’échantillon de protéine. Afin d’obtenir une assez petite quantité d’eau salée, fer 1 quelques mm granules de FeSO4•7H2O solide dehors sur un morceau de peser papier, replier le papier sur le granule et l’écraser avec le côté plat d’une spatule métallique. Ajouter un grain de poudre qui en résulte dans le tube de la protéine. Vortex pour mélanger et une rose couleur rose apparaîtra dans le tube. Incuber la solution rose de protéine, plafonné, de 10 à 30 minutes sur la glace. La couleur rose disparaîtra lentement au fil du temps. Filtration sur gel Utiliser une colonne de gel filtration emballée avec 10 mL de gel de polyacrylamide sphérique avec une limite d’exclusion de poids moléculaire d’environ 6 000 et une gamme de tailles de particules hydraté de 90 à 180 µm dans une colonne de 1.5 x 12 cm, qui est également équipée d’un réservoir de 10 mL. Assurez-vous que la colonne est équipée en bas et lit sup. prend en charge sous la forme de 30 disques um poreux polyéthylène de retenir la résine dans la colonne et éviter le lit de résine de fonctionner à sec. Monter la colonne de gel filtration à un support de bague. Si vous utilisez une colonne de filtration gel pré-packagées, enlever le bouchon et videz l’excès de tampon au-dessus du support du lit supérieur. Pour équilibrer la colonne, commencez par remplir le réservoir avec tampon compatible avec dosage ultérieur et de stockage, par exemple, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % de glycérol à pH 8,0. Si vous utilisez une colonne de filtration gel pré-packagées, casser la pointe de bas de colonne de gel filtration pour démarrer le flux de mémoire tampon et exposer raccord Luer slip. Monter un robinet d’arrêt à l’extrémité du feuillet Luer de la colonne, mais laissez-le ouvert et laissez la colonne à s’écouler par gravité. Lorsque la mémoire tampon a vidé de la colonne et le support de la plateforme supérieure affleure, fermer le robinet et ajouter le ~ 3 mL de la métalloenzyme de Fe (II) reconstitué à la colonne en pipettant également, la solution sur le support de lit sup. exposées. Ouvrir le robinet et laisser l’échantillon entier 3,0 mL entrer dans la colonne par gravité. Jetez ces 3 premières mL d’éluant. N’importe quelle couleur rose qui se forme lors de la manipulation de la solution sera bloqué en haut de la colonne. Lorsque la colonne goutte ne s’échappe et le support de la plateforme supérieure affleure, ajouter 4 mL de tampon gel-filtration (p. ex., 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % de glycérol à pH 8,0) à la colonne. Ouvrir le robinet et recueillir l’éluant dans des tubes de microcentrifuge sur huit fractions de 0,5 mL. Tester les fractions de protéine à l’aide d’un dosage colorimétrique protéique ou UV-Vis27,28 comme décrit précédemment. Combiner des fractions protéiques. Retirer un échantillon pour analyse de SDS-PAGE26. Procéder à l’essai ou l’entreposage de l’échantillon.